DNA甲基化与癌症

DNA甲基化与癌症2018.07.25表观遗传学与DNA甲基化DNA甲基化的检测手段DNA甲基化与癌症一、表观遗传学与DNA甲基化基因型相同现象1：一个生物体的不同组织基因表达模式截然不同表达模式迥异现象2：同卵双生的孪生子具有完全相同的基因组。但他们往往在长大成人后在性格、健康方面往往存在很大差异。现象3：肿瘤抑制基因被过量地甲基化而导致失去活性，而基因的DNA序列并不发生变化。现象4：橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳，叶徒相似，其实味不同。同一种水果，在不同产地生长，其味道，大小，外观可能相差很远。Basketballplayer？Singer？President？TVhost？如果他们出生在不同的地方…基因环境表型表观遗传学相同的基因型不同的表型?什么是表观遗传学？表观遗传学：基因序列无变化基因功能发生变化可遗传并且是可逆的表观遗传学机制：DNA甲基化组蛋白修饰RNA调控（RNA干扰，microRNA,longnon-codingRNA等)表观遗传学/Epigenetics基因型不变的情况下，影响表型并能遗传的现象，称为表观遗传或后生遗传。表观遗传学研究的是在基因组DNA序列不变的情况下，在表型上具有的稳定的、可遗传(或潜在的可遗传性)的变化。定义‘Epi’genetics-‘On’or‘over’thegeneticinformationencodedintheDNA在细胞基因组上存在两类信息：A-遗传学信息B-表观遗传学信息前者——维持细胞活性功能工厂的所有物质材料后者——怎么建、何时建、在哪建的附加信息基因组不仅仅是序列包含遗传信息，而且其修饰也可以记载遗传信息。DNAsequencecodingEpigeneticprogramming表观遗传的特点：广泛，多样，复杂DNA甲基化染色质重塑RNA调控（RNA干扰，非编码RNA:microRNA,longnon-codingRNA等)表观遗传学目前的主要研究发现细胞命运个体发育疾病发生表观遗传调控基因选择表达表观遗传学基因表达前的调控：DNA甲基化、基因印记、染色质重塑基因转录后的调控：ncRNA、miRNA、反义寡核苷酸、核糖开关RNA蛋白翻译后的修饰：组蛋白的甲基化和乙酰化、非组蛋白的共价修饰DNA甲基化组蛋白翻译后修饰RNA机制甲基化是指从活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上将甲基催化转移到其他化合物的过程,可形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。在生物系统内，甲基化是经酶催化的，这种甲基化涉及基因表达的调控、蛋白质功能的调节以及核糖核酸(RNA)加工。甲基化DNA甲基化的概念及机理1950年，Wyatt在Nature上首次指出测序结果表明DNA可能存在第5碱基。DNA甲基转移酶：DNMT胞嘧啶：Cytosine5’-甲基胞嘧啶：5-MethylctosineS-腺苷-甲硫氨酸：SAMS-腺苷-高半胱氨酸：SAHDNMTs活性甲基化合物DNA甲基化可以发生在腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鸟嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位等。但在哺乳动物中DNA甲基化主要发生在5’-CpG-3’的C上生成5-甲基胞嘧啶DNA甲基化（DNAmethylation）DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶（DNMTs）的作用下，将一个甲基添加在DNA分子中的碱基上，最常见的是加在胞嘧啶上，由此形成5-甲基胞嘧啶（5mC）。DNA甲基化位点CpG岛或富含CpG岛的区域CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，而在基因组的某些区段，CpG保持或高于正常概率，这些区段被称作CpG岛。CCAGGCCTGGCCTTGACAGGCGGGCGGAGCAGCCAGTGCGAGACAGGGAGGCCGGTGCGGGTGCGGGAACCTGATCCGGAGGCGGGGGCGGGGCGGGGGCGCAGCGCGCGGGGAGGGGCCGGCGCCCGCCTTCCTCCCCGGGGCCCTCCGGCGTCTGCACTGCAGGAGCGCGGGCGCGGCGCCCCAGCCAGCGCGCAGGGCCCGGGCCCCGCCGGGGGCGCTTCCTCGCCCCGCGCGACCCGCTGCpG岛特征：A、CpG岛主要位于基因的启动子区，部分位于基因的第一个外显子区；B、CpG岛甲基化可以直接导致相关基因的表观遗传学沉默。高等生物基因组甲基化特点1）广泛性2）可遗传性3）可逆性4）组织特异性CpG岛(CpGislands)在结构基因5’端附近的调控区段，CG二联核苷常常以成簇串联的形式排列，含量大于50%。预测软件://广泛性可遗传性DNA修复基因表达的调节癌基因代谢凋亡分化细胞周期DNA甲基化DNA甲基化的功能DNA甲基化的生物学意义DNA甲基化直接影响基因的活化状态DNA甲基化的生物学意义在于：A、基因表达的时空调控B、保护基因组的稳定性表现：基因在不同时期不同身体部位特异表达I.有些基因在发育早期甲基化II.发育晚期被诱导去甲基化III.管家基因低甲基化IV.印记基因高甲基化CpG甲基化与转录活性成反比CpG岛的数目与基因密度相关人类基因组甲基化情况1%-2%的人类基因组是CpG群人类基因组CpG岛约为28890个平均值为每Mb含10.5个CpG岛80%-90%的CpG位点已被甲基化一、DNA甲基化干扰转录因子对DNA元件的识别与结合序列特异性的甲基化DNA结合蛋白与启动子区甲基化CpG岛结合，募集组蛋白去乙酰化酶（HDAC），形成转录抑制复合物，阻止转录因子与启动子区靶序列的结合，从而影响基因的转录。DNA甲基化抑制基因转录的机制没有甲基化基因表达基因启动子区域转录因子结合不能结合甲基化基因不表达甲基化二、序列特异性的甲基化DNA结合蛋白与启动子区甲基化CpG岛结合，募集组蛋白去乙酰化酶（HDAC），形成转录抑制复合物，阻止转录因子与启动子区靶序列的结合，从而影响基因的转录。DNA甲基化抑制基因转录的机制Sin3AMeCP2启动子基因转录因子基因表达启动子基因基因不表达染色质构型的变化伴随组蛋白的乙酰化和去乙酰化，以调控基因转录的开关。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。三、DNA甲基化通过改变染色质结构抑制基因表达DNA甲基化抑制基因转录的机制二、DNA甲基化的检测手段亚硫酸氢盐测序的原理1.直接测序法1.直接测序法注：A：癌组织；B：癌旁组织；○：未甲基化；●：甲基化43A43BM43AE43A43BE43B(369bp)43B2.重亚硫酸盐转化后PCR克隆测序2.重亚硫酸盐转化后PCR克隆测序3.甲基化特异性PCR3.甲基化特异性PCRUMUMUMladder100150200250MSP法检测抑癌基因RASSF1A启动子区的甲基化图MSP检测组织切片DNA甲基化状态电泳图片甲基化特异性PCR（MSP）结果，U为非甲基化，M为甲基化。4.结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法5.基于限制性内切酶的甲基化分析方法6.基于亲和纯化的甲基化分析方法三、DNA甲基化与癌症DNA甲基化与癌症•DNA甲基化与癌症的发生发展有着密切的联系，DNA甲基化改变包括高甲基化和去（低）甲基化。•对不同肿瘤细胞的DNA分析表明，癌变细胞中出现基因突变的概率要远远低于预期，与基因突变相比，DNA甲基化改变在细胞恶变过程中可能发挥了更大的作用。DNA甲基化与癌症的发生发展有着密切的联系高甲基化抑癌基因沉默低甲基化原癌基因被激活CpG岛抑癌基因高甲基化在肿瘤细胞中，抑癌基因启动子区域的CpG岛处于高甲基化状态，因而抑癌基因沉默，使得细胞脱离正常的细胞周期，进入肿瘤发生过程。原癌基因激活正常细胞中，由于甲基化作用原癌基因多处于沉默状态，但在多种肿瘤细胞中，均发现原癌基因处于低甲基化状态，并且低甲基化状态与其蛋白表达升高密切相关，表明低甲基化状态可使原癌基因激活。肿瘤细胞的特性：•现在认为，肿瘤细胞具有以下特征:1.逃避细胞死亡(resistingcelldeath)2.对生长抑制信号不敏感(evadinggrowthsuppressors)3.诱导新血管生成(inducingangiogenesis)4.无限的复制潜能(enablingreplicativeimmortality)5.组织浸润和转移(activatinginvasionandmetastasis)6.持续的增殖信号(sustainingproliferativesignaling)•另外，近年的研究又提出了新的两点:能量代谢的改变(reprogrammingofenergymetabolism)和逃避免疫系统的破坏(evadingimmunedestruction)•以上几点在细胞发生癌变的过程中有着重要的意义.近年来的研究发现，特定基因的DNA高甲基化在这些过程中均发挥重要作用.1.逃避细胞死亡•通常情况下，细胞在接触抑制、辐射、凋亡信号分子等刺激时会发生凋亡，但是癌细胞却可以不受凋亡的控制，而大量分裂增殖.•例如，p53基因是一个重要的抑癌基因，可以促使损伤细胞发生凋亡.50%的癌症中存在p53基因的突变失活.p53基因编码区的甲基化状态容易因为脱氨基作用发生5mC-T的转换.同时，INK4a/ARF基因启动子区域的甲基化可以使表达下降，导致原来受抑制的MDM2表达上升，MDM2进而结合p53并使后者发生蛋白质水平的降解，使细胞逃避p53引起的凋亡圈.DNA高甲基化与癌症2.对生长抑制信号不敏感•细胞生长抑制因子对细胞生长的调控存在多种机制。•在丙肝病毒感染的肝细胞中，发现了丙肝病毒的核心蛋白(coreprotein)可引起p16基因启动子的甲基化，p16表达水平下降从而促进了细胞的分裂，在丙肝诱导的肝癌中起着重要的作用DNA高甲基化与癌症3.诱导新血管生成•新血管的生成是癌症发生中重要的步骤.新血管生成首先需要金属蛋白酶分解细胞外基质，再通过血管内皮生长因子来诱导血管生成。•组织金属蛋白酶抑制剂可以抑制金属蛋白酶的活性，同时与血管内皮生长因子结合阻止血管生成。肿瘤细胞中组织金属蛋白酶抑制剂的下调有一部分原因是由于启动子区域的甲基化引起的.血小管反应蛋白（TSP1）是另一个抑制血管生成的蛋白，TSP1基因启动子区域甲基化引起基因表达抑制，进而导致肿瘤发生过程中细胞外基质重构和血管生成.DNA高甲基化与癌症4.无限的复制潜能•癌细胞无限的复制潜能主要与端粒酶活性的升高有关。端粒酶可以利用RNA逆转录DNA，解决DNA复制时末端缺失的问题。正常情况下端粒酶只有在受精卵和十细胞中才有活性，而肿瘤细胞大多具有高活性的端粒酶。•端粒酶的重要组成部分是人端粒酶逆转录酶。它的活性与端粒酶活性高度相关.引起人端粒酶逆转录酶激活的启动子甲基化有位置特异性，即与启动子特定部位的甲基化及相关区域整体的非甲基化相关。DNA高甲基化与癌症5.组织浸润和转移•组织浸润和转移是细胞恶变的重要特征，近年来这力一面的研究进展迅速.细胞骨架的异常调节与肿瘤转移密切相关。•DFNAS是一个新发现的乳腺癌相关基因.DFNAS可以促进细胞凋亡，而DFNA基因启动子甲基化后的表达抑制导致了肿瘤细胞转移几率增大DNA高甲基化与癌症6.持续的增殖信号•大部分的癌细胞不需要外界的生长刺激因子的作用就可以完成增殖，原因是细胞内的信号转导通路发生了变化，导致促增殖因子作用的增强。•在结直肠癌中发现肿瘤干细胞中SFRPs的启动子区域的高甲基化使其表达抑制，引起了Wnt通路的过度激活而刺激细胞分裂，因而细胞在不需要外界生长刺激因子的作用下就可以不断增殖。DNA高甲基化与癌症•与癌症发生过程中DNA的甲基化不同，DNA的低甲基化既包括特定基因(主要是原癌基因)的低甲基化，还包括基因组范围内