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第七章抗原抗体反应及应用信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏本章提要抗体的制备与应用抗血清的制备单克隆抗体的制备基因工程抗体催化性抗体单抗的医学应用抗原抗体反应抗原抗体反应原理抗原抗体反应特点常见免疫分析方法沉淀反应凝集反应免疫标记技术补体参与的抗原抗体反应免疫分析灵敏度本章小结课后思考题信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏7.1.1抗血清的制备抗原的准备免疫动物动物的选择免疫途径免疫剂量与周期动物采血法抗血清的纯化与保存抗血清的鉴定信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏抗血清与多克隆抗体抗血清(antiserum)：用抗原人工免疫实验动物，可获得含有特异性抗体的血清，称为抗血清。多克隆抗体(polyclonalantibody)：抗血清中抗体是多个抗原决定簇刺激不同B细胞产生的抗体，所以称为多克隆抗体。信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏抗原的准备半抗原与载体偶联制备完全抗原常用的连接反应及双功能连接剂佐剂的使用：佐剂与抗原按1：1比例混合乳化连接基团连接方法（连接剂）-NH2/-COOH碳二亚胺（EDC）法、混合酸酐（MA）法、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）法-NH2/-NH2戊二醛法、SPDP法-NH2/-OH高碘酸钠法、琥珀酸酐法芳香胺基重氮化法-NH2/-SHMBS法、SMPT法、SMBT法信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏动物的选择抗原与免疫动物的种属差异越远越好。对蛋白质抗原，大部分动物皆适合常用的是山羊和家兔；甾体激素免疫多用家兔；酶类免疫多用豚鼠。抗血清量的需要：大动物如马、骡等可获得大量血清（一头成年马反复采血可获得10000ml以上的抗血清）；但有时抗体需要是不多，选用家兔或豚鼠即可。信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏免疫途径一般采用多点注射，一只动物注射总数约为8~10点，包括足掌及肘窝淋巴结周围，背部两侧、颌下、耳后等处皮内或皮下，免疫效果较好；亦有肌肉、腹腔、静脉注射途径。腹腔、肌肉、皮内、皮下注射适合使用任何抗原，刺激局部淋巴结发生免疫应答；静脉注射适合可溶性抗原及分散的单细胞悬液，不使用佐剂，免疫应答主要发生在脾脏。信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏免疫剂量与周期免疫剂量：抗原用量视抗原种类及动物而异，一般大动物抗原剂量（以蛋白抗原为准）约0.5~1mg/只，小动物约0.1~0.6mg/只。免疫周期：初次免疫后，再经2～3次以上的加强免疫，一般3～4周间隔适合大部分动物，小动物10～14天，大动物2月左右。信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏动物采血法颈动脉放血法：这是最常用的方法，对家兔、山羊等动物皆可采用。心脏采血法：此法多用于豚鼠、大鼠、鸡等小动物。此法采血技术应熟练，穿刺不准容易导致动物急性死亡。静脉多次采血法：家兔可用耳中央静脉，山羊可用颈静脉。这种放血法可隔日一次，有时可采集多量血液。信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏抗血清的纯化与保存试血、采血：加强免疫后2－3次，可通过耳静脉或眼球采血，进行抗血清效价测定，当效价达到理想高度，可以心脏直接采血或动脉放血。待血凝后用针筒或吸管吸取血清。抗血清纯化：盐析、层析(离子交换、分子筛、亲和层析)。保存：低温冻存，冻干、加保护剂（叠氮化钠NaN3或BSA）4℃保存。信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏抗血清的鉴定效价鉴定：效价又称滴度（titer），是表达抗血清中特异性抗体相对含量的一个半定量指标，即在一定条件下结合一定量抗原的抗血清的稀释度。亲和力鉴定：亲和力（affinity）指抗血清与相应抗原结合的强度，是描述抗体特异性的重要指标，常用亲和常数K表示。抗体特异性鉴定：常用琼脂双扩散法鉴定抗体特异性。信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏7.1.2单克隆抗体的制备单克隆抗体（monoclonalantibody，MAb）——由单一B细胞克隆合成并分泌的一种组成均一的免疫球蛋白分子，简称单抗。单抗制备的原理单抗制备的材料单抗制备的技术单抗制备流程图信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏单抗制备的原理MAb是单一B细胞克隆产生的，其特异性是针对一个抗原决定簇的，它是B细胞克隆的标志。为使B细胞在体外能长期存活，Kǒhler和Milstein于1975年创建了杂交瘤方法。其基本原理是：将分泌抗体但不能长期培养的B细胞与能长期体外培养但不能分泌抗体的瘤细胞融合，筛选出既能分泌抗体又能长期体外培养的杂交瘤细胞，然后单克隆化，并扩大培养，从而进行单抗生产。信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏单抗制备的材料骨髓瘤细胞：不产生抗体或产生抗体的某种链但不分泌次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷型B细胞——小鼠或大鼠脾脏融合剂——50%的聚乙二醇（PEG）或电脉冲HAT选择培养基——含10%-20%小牛血清和HAT的RPMI1640）信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏单抗制备的技术抗原提纯与动物免疫骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备细胞融合HAT法筛选杂交瘤细胞阳性细胞的筛选、单克隆化与保存单克隆抗体的制备与纯化信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏抗原提纯与动物免疫抗原纯度越高越好，尤其是初次免疫抗原。选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c（巴比塞）健康小鼠，鼠龄在8~12周，雌雄不限，可同时免疫3~4只小鼠。免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同，因动物、抗原形式、免疫途径不同而异，以获得高效价抗体为最终目的，免疫间隔一般2~3周。末次免疫后3~4天，取出脾脏组织，制成单细胞悬液。信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏骨髓瘤细胞与饲养细胞的制备选择瘤细胞株应用最多的是源自BALB/c小鼠的Sp2/0骨髓瘤细胞株，要求是次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）缺陷型（HGPRT-，TK-）。融合时应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞（活性应大于95％）。在培养融合细胞或细胞克隆化培养时，需加入饲养细胞，常用的饲养细胞为小鼠腹腔细胞，可用冷冻果糖液注入小鼠腹腔，轻揉腹部数次，吸出腹腔液即可，其中多为巨噬细胞。信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏细胞融合细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，其基本步骤如下：骨髓瘤细胞与脾脏细胞混合（1:2～1:10）培养，培养液中小牛血清、各种离子和营养成分需严格配制，以保证融合效率；加入40％（W/V）PEG1000~2000使细胞融合；1min后滴加4.5ml培养液；间隔2min滴加5ml培养液，尔后加培养液50ml稀释，消除PEG的作用。信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏HAT法筛选杂交瘤细胞哺乳动物DNA合成的两条途径：salvagepathway替代合成途径胸腺嘧啶（T）胸腺嘧啶激酶（TK）次黄嘌呤（H）次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶（HGPRT）核苷酸染色体DNAdonovopathway从头合成途径磷酸核糖焦磷酸尿嘧啶叶酸核苷酸氨基蝶呤（A）信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏阳性细胞的筛选、单克隆化与保存筛选ELISA、Dot-ELISA、凝集试验、免疫印迹、免疫荧光试验单克隆化有限稀释法荧光激活细胞分拣法（FACS）保存冰冻保存，温度越低越好，研究显示，液氮保存的细胞株活性仅有轻微下降。信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏单克隆抗体的制备与纯化筛选出阳性细胞株进行抗体制备，有两种方法：增量培养法：即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体，如大瓶培养法、中空反应器法。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法：将杂交瘤细胞接种到弗氏佐剂处理的BALB/c小鼠腹腔中去，通常在接种一周后即有明显的腹水产生，抗体含量较高且杂蛋白较少，每只小鼠可收集5~10ml的腹水。单抗的纯化方法与多抗相同。信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏7.1.3基因工程抗体基因工程抗体是利用DNA重组技术，在基因水平上对Ig分子进行剪接、修饰，甚至是人工合成后导入受体细胞表达，而制备的一种新型抗体。根据基因工程抗体的结构不同，可以分为：人－鼠嵌合抗体改型抗体双特异性抗体小分子抗体基因工程抗体的结构与特性信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏人－鼠嵌合抗体结构：鼠源V区或Fab＋人源C区或Fc制备：从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人－鼠嵌合抗体。特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏改型抗体结构：将鼠单抗的CDR移植至人源抗体可变区，替代人源抗体CDR，故又称CDR移植抗体。特点：抗体CDR直接决定抗体的特异性，改型抗体使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性，同时减少其异源性。信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏双特异性抗体结构特点：由异源性的H2＋L2构成，具备结合两种不同抗原的特点，又称双功能抗体。制备：将两套轻链、重链基因导入骨髓瘤细胞中，选择合适的抗体恒定区及Ig类型表达。应用：将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易杀伤肿瘤细胞。信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏小分子抗体源自抗体且保持抗原结合能力，但不具备完整抗体结构的一系列小分子。典型的小分子抗体有：单链抗体scFv由VH－连接肽－VL组成，它质量很小，作为异种蛋白抗原性较小，组织穿透力强，是目前研究最活跃的基因工程抗体之一，可用噬菌体转染细菌大量制备。其他小分子抗体还有：Fab、Fv，单域抗体（VH），最小识别单元（CDR）等。信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏基因工程抗体的种类及其特性种类基本结构相对分子质量(kD)鼠源性成分人－鼠嵌合抗体鼠源V区/Fab＋人源C区/Fc15025%~30%改型抗体以鼠源CDR替换人源CDR15015%双特异性抗体异源性H2/L215033％小分子抗体Fab完整L链和部分H链5015%FvVH非共价连接VL2515%单链抗体VH－连接肽－VL2615%单域抗体VH12.57.5%最小识别单元单一CDR﹤2﹤1.5%信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏7.1.4催化性抗体一种具有催化化学反应活性的抗体，又称抗体酶（abozyme），表现出对底物立体结构的专一性，催化的化学反应特异性高于酶，效率低于常规酶类。通过设计稳定的转换态类似物作为半抗原，与载体蛋白交联后免疫动物，可制备催化性抗体：先筛出与底物或半抗原结合的抗体，再从中筛出有催化活性的抗体；对底物进行适当修饰，使催化反应的产物可直接表现抗体的催化活性。信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏7.1.5单抗的医学应用单克隆抗体的均一性和生物活性单一性，使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范化。目前已有许多检验试剂盒用单抗制成，其主要用途如下：单克隆抗体具有灵敏度高、特异性好的特点，可用于各类病原体的诊断，这是单克隆抗体应用最多的领域。对肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原进行检测，用于肿瘤的诊断、分型及定位。信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏检测淋巴细胞的表面标志，用于区分细胞亚群和细胞分化阶段。应用单克隆抗体和免疫学技术，可对机体的多种微量成分进行测定，以便判断健康状态、检出疾病、指导诊断和治疗等。鼠源性单抗作为体外诊断试剂是满意的，但用于人体可能会引起过敏反应甚至危及生命。目前虽然已通过人－鼠细胞杂交及人－人细胞杂交进行了一些探索，但还不能商品化生产，因此制备人源单克隆抗体是目前亟待解决的问题。信阳农业高等专科学校生物技术系2011春夏7.2.1抗原抗体反应原理抗原抗体反应可分为两个阶段：抗原与抗体发生特异性