miRNA

生化专题miRNA及其功能研究进展被美国《Science》杂志评为2002年世界十大科技突破第一名1.miRNA的概念2.miRNA的特征3.miRNA的生成和作用机制4.miRNA与siRNA的区别和联系5.miRNAs的识别方法7.miRNA的研究动向及展望6.miRNA研究的重要意义作为Science2002年十大科技突破的第一名－－microRNA成为生物学研究的一大焦点。它在生物的发育时序调控和疾病的发生中起到非常重要的作用。研究发现，它与siRNA有很多相似之处，但也有很大不同。对microRNA的研究将会对转录后基因调节领域的发展产生深远影响。miRNA是microRNA(微RNA)的简称,是一些5′端带磷酸基团、3′端带羟基的,长度为22(19～25)核苷酸左右的非编码调控RNA家族。miRNA广泛存在于多种真核生物中。最早发现的miRNA是线虫中的let-7和lin-4。运用多种实验方法以及生物信息学方法，已经找到了几千种miRNA(表1)。1.miRNA的概念miRNA是一类长度很短的非编码调控单链小分子RNA,长度约21～22个核苷酸(少数小于20个核苷酸),通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或阻遏其翻译,从而对基因进行转录后表达的调控。MicroRNAs是最早于1993年在线虫中发现的抑制性小RNA分子。miRNAs在物种进化中相当保守，在植物、动物和真菌等多细胞真核生物中发现的miRNAs只在特定的组织和发育阶段表达。miRNA的组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用。通过对已发现的miRNA的基因序列、加工表达方式、生理功能等方面的研究表明:miRNA具有与生物体阶段性发育密切相关的重要调控功能。但也可能参与了空间发育、应激性、细胞周期和基因重组等过程。现在除了lin-4和let-7外,其它miRNA统一用miR#(#代表数字)表示miRNA,而mir#(#代表数字)表示相应的编码基因。1）广泛存在于真核生物中,是一组不编码蛋白质的短序列RNA,它本身不具有开放阅读框架(ORF)2）通常的长度为20～24nt3）成熟miRNA的5′端是磷酸基,3′端为羟基4）具有生物间高度的保守性5）具有基因簇集现象6）表达具有细胞特异性或组织特异性7)表达呈现时序特异性2.miRNA的特征3.miRNA的生成和作用机制据体内外实验研究表明，miRNA的生成至少需要两个步骤（图1）:a)在细胞核内，由长的内源性转录本(pri-miRNA)生成70nt的具有茎环结构的miRNA前体(pre-miRNA);b)在细胞质内，在Dicer作用下将pre-miRNA加工为成熟的miRNA。(图1所示的是miRNA合成及作用通路并附siRNA的通路以作比较)Drosha酶介导从pri-miRNA到~70ntpre-miRNA的剪切过程，该过程发生在核内。Drosha和Dicer酶均为RNaseIII家族的成员。RNaseIII是双链RNA特异性核酸内切酶(图2)。miRNA的作用机制－－至少有2种作用机制1）与靶mRNA的3′端非翻译区（UTR）结合，介导翻译调控－－miRNA与靶mRNA的3′-UTR区是一种非完全互补结合，阻止靶mRNA的翻译，影响蛋白质表达水平，从而抑制基因表达，但并不影响靶mRNA的稳定性2）与靶mRNA的翻译区结合，直接引起切割－－类似RNAiHutvagner等(2002)对miRNAlet-7的研究,发现了一个规律：miRNAs与mRNAs结合的互补程度决定了miRNAs将以何种机制发生作用，即完全的互补引起RNAi，不完全互补则导致翻译抑制（图3）。4.miRNA与siRNA的区别和联系区别：①siRNA是在病毒感染或人工插入dsRNA后诱导而成的;而miRNA则是细胞内RNA的固有组分之一②siRNA来源于转基因或病毒RNA;miRNA来源于内源转录本③siRNA由长dsRNA转变而来；miRNA由具有发夹状结构的pre-miRNA转变而来④siRNA主要以双链形式存在,其3′端存在2个非配对的碱基通常为UU；miRNA主要以单链形式存在⑤siRNA与靶mRNA完全互补配对结合；miRNA与靶RNA并不完全互补,存在错配现象⑥对靶RNA的特异性不同：siRNA的靶序列有一个核苷酸突变,就会影响到RNAi的沉默效应；若靶RNA有一个位点突变,miRNA是不能完全识别的,也不会影响到miRNA途径的调节效应⑦siRNA通过RNAi途径发挥功能;miRNA通过miRNA途径发挥作用,也能直接介导RNAi,靶向裂解mRNA⑧miRNA可能比siRNA的功能更加广泛,它能在RNA代谢的多个层面上对与其同源的底物进行调控联系：①二者的长度都约22nt左右②二者同是Dicer产物,因此具有Dicer产物的特点③二者的生成都需Argonaute家族蛋白存在④二者同是RISC的组分,因此在siRNA和miRNA介导的沉默机制上有重叠5.miRNAs的识别方法●多个研究小组采用生物化学结合生物信息学的方法开展对miRNAs的研究工作。●由于据推测miRNAs都是由Dicer酶降解RNA得到的,21～23个碱基大小、有5’端磷酸基和3’羟基的RNA片断,有的实验室采用改良的定向克隆方法筛选具有相同特征的小分子-----筛选一定大小的RNA分子,连接到3’和5’的适配子（adapters）,逆转录并通过PCR扩增、亚克隆和测序。miRNA前体在基因组上的定位和聚类是通过向基因组数据库查询进行。该方法有助于判断miRNAs是否是mRNAs,tRNAs,rRNAs等分子的降解产物。●有的实验室通过一种RNAfoldingprogram‘mfold’软件来判断C.elegans和C.briggsae之间的高度保守区域是否含有潜在的miRNA前体，然后用NorthernBlots方法来确定这些miRNAs是否真正表达了。尽管有数百个miRNAs通过生化或者是生物信息学的方法被鉴别出来,但这只不过是沧海一粟。由于很多已鉴别出来的miRNAs是从单个克隆中鉴别出来的,所以可以假设还有很多miRNAs在分离和鉴定过程中被“漏掉”了,测序工作还远远不够。6.miRNA研究的重要意义RNA一度被认为仅仅是DNA和蛋白质之间的“过渡”,但越来越多的证据清楚地表明，RNA在生命的进程中扮演的角色远比我们早前设想的更为重要。随着对小分子RNA研究的不断深入,研究人员开始认识到:小分子RNA的世界一点都不小!miRNA研究的飞速发展也得益于RNAi的发现.但与此不同的是,miRNA是生物体内源的小RNA分子,研究表明它们在生物体内不仅仅是代谢的产物,而是机体有目的编码的重要的调控分子。它们参与生物体的生长、发育、衰老、死亡的调控。随着研究的深入,miRNA将在生命起源和物种进化、基因表达调控的复杂性、疾病发生和发展的机制等方面起到更为深远的作用。同时,miRNA的研究亦将为RNAi技术的应用提供新的依据、思路和空间。现在,欧美等发达国家已将有关miRNA的研究广泛而深入地运用到组织器官的定向发育,细胞生长分化的时空调节,信号通路的开启和关闭,细胞周期的监测与调控,学习与记忆,肿瘤的逆分化,肥胖、衰老和死亡,疾病的防治以及有目的的基因表达调控上。举例1：miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程,包括早期发育(Reinhart2000),细胞增殖,细胞凋亡,细胞死亡(Brennecke2003）,脂肪代谢（Xu2003)和细胞分化(Kawasaki2003)。尽管对miRNA的研究还处于初级阶段,据推测miRNAs在高级真核生物体内对基因表达的调控作用可能和转录因子一样重要。有一种看法是:miRNAs可能代表在一个新发现的层次上的基因表达调控方式。举例2：一项研究表明,2个miRNAs水平的下降和慢性淋巴细胞白血病之间显著相关,提示miRNAs和癌症之间可能有潜在的关系(Calin2002)。然而，大多数miRNAs的功能仍然是个谜?!2007年《Science》十大科学进展以miRNA、人工制造的微生物、新的计算机芯片材料等作为了2008年应该注意的领域，其中小分子RNA这个让人目眩神迷的“神奇小子”可以说发展前景不可限量。然而无论从基础研究还是治疗药物学研究方面，小分子RNA研究还属于幼年期。2007年研究人员发现miRNAs这种非编码RNAs不仅只用于抑制基因表达，而且也具有转录激活这一完全相反的作用；同时在miRNA基础功能研究方面，研究人员还发现miRNA能引起肿瘤扩散，促进实体肿瘤转移，侵染其它组织，这些都说明对于miRNA的功能了解我们还尚未看清楚其“庐山真面目”。寻找调控的miRNA基因以及miRNA的靶基因,揭示miRNA具体的作用机制是非常重要的.现在摆在科学家们面前的两大问题就是:在各种生物中找齐这些miRNA和找到它们的靶基因并揭示它们的功能,这也可以说是后基因组时代需要解决的问题之一。7.miRNA的研究动向及展望7.17.2由于siRNA、miRNA及其他小RNA的发现使得RNA转变为当今世界的研究热点。当前我们所面临的挑战是:这些miRNA到底具有何功能,它们是如何识别潜在反义的靶mRNA,这些miRNA间相互调节作用的结果是什么。总之,未来的世界是RNA的世界,它将是生命科学领域里新的研究热点。