细胞裂解

我以前做蛋白大量表达超声破碎时，总体积为200ml，功率300瓦，超3秒，停3秒，60次为一个循环，每个循环之间停5min，共作了3个循环，效果很好。不知你的“原来的80倍”是多少，如果和我的差不多，是要延长总时间，但要注意样品要放在冰上，中间停一会，防止产生的热量太多，使蛋白变性。我的方案是：1细胞先用无菌PBS洗二次；2吹下细胞后，4度12000rpm/min离心10min，再用无菌PBS悬浮，重复离心一次；3常规超声波处理。注意事项：1全部处理过程一定要在冰上进行；2超声波时，一定不要有泡沫产生；3在冰上超声波处理。由于上次求助无人回应，一气之下遍找资料，汇总出菌体/细胞裂解的常用方法和配方，希望能对其它求助兄弟有所帮助。菌体/细胞裂解法汇总一、反复冻融法：1、将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。=%B4%F3%B3%A6%3B%B8%CB%BE%FA%2C%C1%D1%BD%E2&url=http%3A//=0&a=3&user=baidu2、至少3次以上冻溶。、IFCC推荐法：收集细胞悬液，4℃低温离心（3000rpm，5min），弃上清，加入一定量PBS（200ul），轻轻吹打混匀，-200C冷冻30min，370C解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液。、用液氮冻融三四次就可以了，细胞冻住后，取出放37度水浴，溶解后震荡，再冻=89&ID=142945&replyID=597858&skin=1二、超声波处理法1、要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数20次。、每个样本超声时间5秒,每个间隔5秒,粉碎5次。、100ml菌液离心，用8ml缓冲液悬浮，加8mg溶菌酶，冰浴30min，然后超声处理。750W40％功率。5秒超声，9秒间隔。超声至少90min。、综合冻融和超声的方法：1500g离心，弃除上清。冰上，用小体积PBS重悬细胞。将重悬液集中，1500g离心浓缩，弃除上清。液氮骤冷。用约5倍体积的PBS缓冲液重悬细胞，并搅拌。可选择：4℃下超声破碎细胞。加入终浓度为0.25M的KCl，15mM的DTT。4℃下111500g×60min离心裂解液。取出上清。过柱子。PurificationofGST-FusionProteinsfromE.coli-AlternateProtocol三、渗透法：冰冷的20mmol/LTris-Cl（pH8.0），2.5mmol/LEDTA处理，冰浴放置10min。《精编分子生物学实验指南》四、裂解液处理法：1、细胞裂解液：50mmol/LTris-ClpH6.8，100mmol/LDTT，2%SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油。SDS是阴离子型表面活性剂、极易促溶、强变性作用。、在loadingbuffer加SDS，100度5分钟，是变性方法。SDS与蛋白等量结合，可以通过条带位移判断蛋白大小，考染不会影响结果。=65&id=4936753&sty=3&keywords=SDS+%C1%D1%BD%E23、如果是做小量菌液，跑PAGE胶看其表达情况的话，可以直接加蛋白loadingbuffer煮沸5分钟即可，需注意的是上样前要离心12000rpm至少5分钟，然后上样时，枪头别吸最底下的。、20毫升细胞裂解液配方:40μL0.5MEDTA(PH8.0)，4ml10%SDS，1ml1MTris-cl(PH6.8)，14.96ml蒸馏水。、我始终未明白楼主如果想收集全蛋白，而不考虑包涵体的话，为何要用超声呢？直接水煮不就可以了吗？、将1ml菌离心弃上清，留大概50ul，再加50ul2×上样缓冲液，煮10min，取20ul上样，就可以了。=65&id=4591035&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#45910357、检测蛋白诱导：从培养的不同时期各取出1ml，12000g×1min离心。将沉淀重悬于100ul1×SDS上样缓冲液（50mMTris-Cl（pH6.8），100mMDTT，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油）中，100℃加热3min，然后12000g×1min离心。上样15ul，6％SDS-PAGE电泳。《分子克隆》P8268、5-10秒离心，弃除上清，用50ul蒸馏水重悬沉淀。加入1ulPMSF，再加入50ul热的2×SDS上样缓冲液（100℃加热）。迅速混匀后100℃加热3-5min。将样品冰上放置（或-20℃放置），然后再溶解，煮沸1min。离心30秒。上样5ul进行SDS-PAGE电泳。2×SDS上样缓冲液：250mMTris-Cl，6.2％（w/v）DTT，8％SDS，0.002％（w/v）溴酚蓝，40％甘油。PurificationofGST-FusionProteinsfromE.coli。9、裂解液：50mMTris-HCl(pH8.5~9.0)，2mMEDTA，100mMNaCl，0.5%TritonX-100，1mg/ml溶菌酶。=%B4%F3%B3%A6%3B%B8%CB%BE%FA%2C%C1%D1%BD%E2&url=http%3A//=0&a=3&user=baidu10、我们用NP40（NP40：NONIDETp-40乙基苯基聚乙二醇，是一种非离子表面活性剂。）加DTT和蛋白酶抑制剂裂解细胞，冰上放30－60min，然后13000rpm离心15min，取上清定量。=89&ID=112749&replyID=421724&skin=111、裂解液配方是：50mmol/LTirs-HCI(PH8.0)，150mmol/LNaCI，0.02%叠氮钠，100μg/mlPMSF，1μg/mlAprotinin，1%TritonX-100(orNP-40)。、对于组织培养中生长的细胞，最有效的裂解方法是用去污剂（表面活性剂）进行处理，溶解细胞膜并溶解蛋白质。50mmol/LTirs-HCl(PH8.0)、150mmol/LNaCl、0.02%叠氮钠、100μg/mlPMSF、1μg/mlAprotinin、1%TritonX-100(orNP-40)，这种裂解液可能是最常用的裂解缓冲液。、细胞裂解液的主要目的：（1）利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；（2）溶解蛋白；（3）蛋白变性使其稳定；（4）抑制蛋白酶活性。推荐RIPAbuffer:50mMTris-HClpH7.4（缓冲体系），150mMNaCl（等渗体系），1mMPMSF（强大的蛋白酶抑制剂），1mMEDTA（变性剂和稳定剂），5µg/mlAprotinin（蛋白酶抑制剂），5µg/mlLeupeptin（蛋白酶抑制剂），1%Tritonx-100（破坏细胞），1%Sodiumdeoxycholate（中度变性剂和蛋白溶解剂），0.1%SDS（强变性剂和蛋白溶解剂）。、裂解buffer：50mMHEPESpH7.0，1mM甘油，1mMDTT（还原剂），7M尿素，2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解），1mMEDTA(金属鏊合剂），1mMPMSF，1mg/mlleupeptin，1mg/mlaprotinin，1mg/mlpepstatin(蛋白酶抑制剂），50mMNaF(ph7.0)（antihemoaggulating），1mMNa3VO4(ph7.0)（inhibitorofphosphatases），2mMbenzamidine（inhibitoroftrypsin）。、可选择：取0.5ml诱导的细胞并离心2min。弃除上清，用100ul1×SDS上样缓冲液重悬，冰上放置。6000rpm×10min离心培养物。弃除上清，用10ml预冷的裂解液重悬沉淀。液氮骤冷细胞或-20℃冷冻细胞。在冷水中溶解细胞。15秒、4次超声处理细胞。冰浴降温。4℃，9000g×30min离心。取上清。裂解液：5mMDTT，15mMKCl，5mMMgCl2，50mMHEPES,pH7.9，1mMEDTA，10mg/ml溶菌酶（临用前加上DTT和溶菌酶）。PurificationofGST-FusionProteinsfromE.coli-BasicProtocol16、收集细胞。在液氮中突然冷冻细胞。用含有蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液悬浮沉淀。用100µg/ml溶菌酶处理并在冰上孵育15min。加上10%N-laurylsarcosine(终浓度1.5%)，然后超声波破碎。16000rpm×30min离心。取上清然后加入TritonX-100至终浓度为2.0%。过Ni-NTA–琼脂糖柱层析。破碎使用FrenchPress，1000psi过3遍（或以上）如果没有FrenchPress，就用超声，效果没那么好。然后细胞低速离心（3000g）去掉未破碎细胞，超高速（200000g）离心得到膜碎片。然后用合适的detergent将膜蛋白从膜上释放出来。超声的时候产生泡沫容易引起蛋白变性,从而影响活性。如有气泡，应吸去或放在冰上待泡消失，再继续超声裂解。超声波的型号不一样，可能设置是不一样的，我们用宁波新芝的，我是0.2-0.4KW，间歇2秒，工作1秒，超40至60次（如果是裂解细菌，关键是让细菌的云雾状消失即可）