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Chapter5-6EnzymaticcatalysisinNon-aqueoussystem第五章第六节酶的非水相催化p59Contentsofchapter71、酶非水相催化的研究概况2、有机介质反应体系3、酶在有机介质中的催化特性4、有机介质中酶催化反应的条件及其控制5、酶非水相催化的应用第一节酶非水相催化的研究概况水是酶促反应昀常用的反应介质。但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为许多有机化合物（底物）在水介质中难溶或不溶。由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反应的发生。是否存在非水介质能保证酶催化？？1984年，克利巴诺夫（Klibanov）等人在有机介质中进行了酶催化反应的研究，他们成功地在利用酶在有机介质中的催化作用，获得酯类、肽类、手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应。酶非水相催化的几种类型（1）有机介质中的酶催化有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能。（2）气相介质中的酶催化酶在气相介质中进行的催化反应。适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。由于气体介质的密度低，扩散容易，因此酶在气相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点。（3）超临界流体介质中的酶催化酶在超临界流体中进行的催化反应。超临界流体是指温度和压力超过某物质超临界点的流体。（4）离子液介质中的酶催化酶在离子液中进行的催化作用。离子液（ionicliquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点。第二节有机介质中水和有机溶剂对酶催化反应的影响一、有机介质反应体系1、非极性有机溶剂-酶悬浮体系（微水介质体系）用非极性有机溶剂取代所有的大量水，使固体酶悬浮在有机相中。但仍然含有必需的结合水以保持酶的催化活性（含水量一般小于2%）。酶的状态可以是结晶态、冻干状态、沉淀状态，或者吸附在固体载体表面上。2、与水互溶的有机溶剂-水单相体系有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系。酶、底物和产物都能溶解在这种体系中。如辣根过氧化物酶（HRP）p2093、非极性有机溶剂-水两相/多相体系由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂（高脂溶性）相所组成的两相体系。4、（正）胶束体系胶束又称为正胶束或正胶团，是在大量水溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂，加入表面活性剂后形成的水包油的微小液滴。表面活性剂的极性端朝外，非极性端朝内，有机溶剂包在液滴内部。反应时，酶在胶束外面的水溶液中，疏水性的底物或产物在胶束内部。反应在胶束的两相界面中进行。5、反胶束体系反胶束又称为反胶团，是指在大量与水不相混溶的有机溶剂中，含有少量的水溶液，加入表面活性剂后形成的油包水的微小液滴。表面活性剂的极性端朝内，非极性端朝外，水溶液包在胶束内部。反应时，酶分子在反胶束内部的水溶液中，疏水性底物或产物在反胶束外部，催化反应在两相的界面中进行。不管采用何种有机介质反应体系，酶催化反应的介质中都含有机溶剂和一定量的水。它们都对催化反应有显著的影响。二、水对有机介质中酶催化反应的影响酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才能进行催化反应。所以酶在有机介质中进行催化反应时，水是不可缺少的成分之一。有机介质中的水含量多少对酶的空间构象、酶的催化活性、酶的稳定性、酶的催化反应速度等都有密切关系，水还与酶催化作用的底物和反应产物的溶解度有关。1、水对酶分子空间构象的影响酶分子需要一层水化层，以维持其完整的空间构象。维持酶分子完整的空间构象所必需的昀低水量称为必需水（essentialwater）。必需水与酶分子的结构和性质有密切关系。不同的酶，所要求的必需水的量差别很大。p2112、水对酶催化反应速度的影响有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响。p211在催化反应速度达到昀大时的水含量称为昀适水含量。在实际应用时应当根据实际情况，通过实验确定昀适水含量。3、水活度在有机介质中含有的水，主要有两类，一类是与酶分子紧密结合的结合水，另一类是溶解在有机溶剂中的游离水。研究表明，在有机介质体系中，酶的催化活性随着结合水量的增加而提高。水活度（wateractivity,Aw）是指体系中水的逸度（fugacity）与纯水逸度之比。通常可以用体系中水的蒸汽压与相同条件下纯水的蒸汽压之比表示。即：Aw=P/P0式中，P为在一定条件下体系中水的蒸汽压，P0为在相同条件下纯水的蒸汽压。研究表明，在一般情况下，昀适水含量随着溶剂极性的增加而增加。而昀佳水活度与溶剂的极性大小没有关系。所以采用水活度作为参数来研究有机介质中水对酶催化作用的影响更为确切。三、有机溶剂对有机介质中酶催化反应的影响常用的有机溶剂有辛烷，正己烷，苯，吡啶，季丁醇，丙醇，乙腈，已酯，二氯甲烷等。1、有机溶剂对酶结构与功能的影响酶具有完整的空间结构和活性中心才能发挥其催化功能。在水溶液中，酶分子均一地溶解于水溶液中，可以较好地保持其完整的空间结构。在有机溶剂中，酶分子（经过修饰后可溶于有机溶剂者除外）不能直接溶解，而是悬浮在溶剂中进行催化反应。有些酶在有机溶剂的作用下，其空间结构会受到某些破坏，从而使酶的催化活性受到影响甚至引起酶的变性失活。（1）有机溶剂对酶分子表面结构的影响酶在有机介质中与有机溶剂接触，酶分子的表面结构将有所变化。（2）有机溶剂对酶活性中心结合位点的影响当酶悬浮于有机溶剂中，有一部分溶剂能渗入到酶分子的活性中心，与底物竞争活性中心的结合位点，降低底物结合能力，从而影响酶的催化活性。有机溶剂分子进入酶的活性中心，会降低活性中心的极性，可能降低酶与底物的结合能力。2、有机溶剂对酶活性的影响有些有机溶剂，特别是极性较强的有机溶剂，如甲醇，乙醇等，会夺取酶分子的结合水，影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性，甚至引起酶的变性失活。有机溶剂极性的强弱可以用极性系数lgP表示。P是指溶剂在正辛烷与水两相中的分配系数。极性系数越大，表明其极性越小；反之极性系数越小，则极性越强。研究表明，有机溶剂的极性越强，越容易夺取酶分子结合水，对酶活力的影响就越大。极性系数lgP2的极性溶剂一般不适宜作为有机介质酶催化的溶剂使用。3、有机溶剂对底物和产物分配的影响有机溶剂与水之间的极性不同，在反应过程中会影响底物和产物的分配，从而影响酶的催化反应。有机溶剂能改变酶分子必需水层中底物和产物的浓度。一般选用2≤lgP≤5的有机溶剂作为有机介质为宜。第三节酶在有机介质中的催化特性酶在有机介质中起催化作用时，由于有机溶剂的极性与水有很大差别，对酶的表面结构、活性中心的结合部位和底物性质都会产生一定的影响，从而显示出与水相介质中不同的催化特性。底物特异性立体选择性区域选择性键选择性热稳定性pH值特性一、底物专一性在有机介质中，由于酶分子活性中心的结合部位与底物之间的结合状态发生某些变化，致使酶的底物特异性会发生改变。不同的有机溶剂具有不同的极性，所以在不同的有机介质中，酶的底物专一性也不一样。在极性较强的有机溶剂中，疏水性较强的底物容易反应；而在极性较弱的有机溶剂中，疏水性较弱的底物容易反应。二、对映体选择性酶的对映体选择性（enantioselectivity）又称为立体选择性或立体异构专一性，是酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体的能力大小的指标。酶立体选择性的强弱可以用立体选择系数（KLD）的大小来衡量。立体选择系数（KLD）与酶对L-型和D-型两种异构体的酶转换数（Kcat）和米氏常数（Km）有关。即：DmcatLmcatLDKKKKK)/()/(Kcat:酶的转换数。指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。立体选择系数越大，表明酶催化的对映体选择性越强。酶在有机介质中催化，与在水溶液中催化比较，由于介质的特性发生改变，而引起酶的对映体选择性也发生改变。酶在水溶液中催化的立体选择性较强，而在疏水性强的有机介质中，酶的立体选择性较差。三、区域选择性酶在有机介质中进行催化时，具有区域选择性（regioselectivity），即酶能够选择底物分子中某一区域的基团优先进行反应。酶区域选择性的强弱可以用区域选择系数Krs的大小来衡量。区域选择系数与立体选择系数相似，只是以底物分子的区域位置1、2，代替异构体的构型L、D。即：212,1)/()/(mcatmcatKKKKK四、键选择性酶在有机介质中进行催化的另一个显著特点是具有化学键选择性。键选择性与酶的来源和有机介质的种类有关。五、热稳定性许多酶在有机介质中的热稳定性比在水溶液中的热稳定性更好。酶在有机介质中的热稳定性还与介质中的水含量有关。通常情况下，随着介质中水含量的增加，其热稳定性降低。在有机介质中，酶的热稳定性之所以增强，可能是由于有机介质中缺少引起酶分子变性失活的水分子所致。表7-1某些酶在有机介质与水溶液中的热稳定性酶介质条件热稳定性猪胰脂肪酶三丁酸甘油酯水，pH7.0T1/226hT1/22min酵母脂肪酶三丁酸甘油酯/庚醇水，pH7.0T1/2=1.5hT1/22min脂蛋白脂肪酶甲苯，90℃，400h活力剩余40％胰凝乳蛋白酶正辛烷，100℃水，pH8.0,55℃T1/2=80minT1/2=15min枯草杆菌蛋白酶正辛烷，110℃T1/2=80min核糖核酸酶壬烷，110℃，6h水，pH8.0,90℃活力剩余95％T1/210min酸性磷酸酶正十六烷，80℃水，70℃T1/2=8minT1/2=1min腺苷三磷酸酶(F1-ATPase)甲苯，70℃水，60℃T1/224hT1/210min限制性核酸内切酶（HindⅢ）正庚烷，55℃，30d活力不降低β-葡萄糖苷酶2-丙醇，50℃，30h活力剩余80％溶菌酶环己烷，110℃水T1/2=140minT1/2=10min酪氨酸酶氯仿，50℃水，50℃T1/2=90minT1/2=10min醇脱氢酶正庚烷，55℃T1/250d细胞色素氧化酶甲苯，0.3％水甲苯，1.3％水T1/2=4.0hT1/2=1.7min表7-1某些酶在有机介质与水溶液中的热稳定性六、pH值特性在有机介质反应中，酶所处的pH环境与酶在冻干或吸附到载体上之前所使用的缓冲液pH值相同。这种现象称之为pH印记（pH-imprinting）或称为pH记忆。酶在有机介质中催化反应的昀适pH值通常与酶在水溶液中反应的昀适pH值接近或者相同。利用酶的这种pH印记特性，可以通过控制缓冲液中pH值的方法，达到控制有机介质中酶催化反应的昀适pH值。酶在有机介质中由于水分子的减少，相对来说酶分子的构象表现出比水溶液中更具有“刚性”特点。因而使通过选择不同性质的溶剂来调控酶的某些特性成为可能。例如在有机溶剂中，可以利用酶与配体的相互作用性质，诱导改变酶分子的构象，调控酶的底物专一性、立体选择性和手性选择性等。由于引起酶变性的许多因素都与水的存在有关，因此在有机介质中酶的稳定性得到显著提高。由于有机溶剂的存在，水量减少，大大降低了许多需要水参与的副反应，如酸酐的水解、氰醇的消旋化和酰基转移等。在有机介质中进行的酶促反应，可以省略产物的萃取分离过程，提高收率。有机介质酶催化反应的优点第四节有机介质中酶催化反应的条件及其控制酶在有机介质中可以催化多种反应，主要包括：合成反应、转移反应、醇解反应、氨解反应、异构反应、氧化还原反应、裂合反应等。主要应控制的条件有酶的种类和浓度底物的种类和浓度有机溶剂的种类水含量温度pH离子强度一、有机介质中酶催化反应的类型1、合成反应①脂肪酶或酯酶在有机介质中可以催化有机酸和醇进行酯类的合成反应。②蛋白酶可以在有机介质中催化氨基酸进行合成反应，生成各种多肽。2、转移反应3、醇解反应4、氨解反应