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实验四革兰氏染色法一目的要求：1、学习并掌握革兰氏染色法。2、了解革兰氏染色法的原理。3、巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。二、实验器材：1.菌种：大肠杆菌16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物、金黄色葡萄球菌16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。2.溶液或试剂：革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，lugol碘液，95%乙醇，番红复染液等。3.仪器或其他用品：酒精灯、载玻片、显微镜、双层瓶、擦镜纸、接种环、试管架，镊子，载玻片夹子，滤纸、滴管和无菌生理盐水等。三、实验原理：1、无菌操作技术：高温对微生物具有致死效应，因为在微生物的转接过程中，一般在火焰旁进行，并用火焰直接灼烧接种环，以达到灭菌的目的，但一定要保证其冷却后方可进行转接，以免烫死微生物。2、细菌制片：涂片法：涂抹——细胞个体在载玻片上均匀分布，避免菌体堆积而无法观察个体形态。加热——固定使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上，这种加热处理还可以杀死大多数细菌而且不破坏细胞形态。3、革兰氏染色：革兰氏染色是丹麦医生HansChristianGram于1884年发明的一种鉴别不同类型细菌的染色方法。细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的结构和组分的差异所决定的。初染——所有细菌都被染成结晶紫的蓝紫色。碘——媒染剂，与结晶紫结合成结晶紫—碘的复合物，增强染料在菌体中的滞留能力。脱色剂——革兰氏阳性菌细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且类脂质含量低，乙醇处理可以使肽聚糖所具有的网状结构收缩使碘—结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体持原有的蓝紫色；革兰氏阴性菌细胞壁肽聚糖含量低，交联度低，壁薄且类脂质含量高，乙醇处理时，脂质溶解，细胞壁通透性增大，使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，菌体变为无色，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。四、实验方法涂片干燥固定染色水洗干燥镜检革兰氏染色法涂片干燥固定初染水洗媒染水洗脱色水洗复染水洗镜检1min1min0.5min涂片：取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌种(金黄色葡萄球菌或大肠杆菌)与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。干燥：涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过2~3次，共约2~3秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃）,放置待冷后，进行染色。染色(1)初染:滴加结晶紫染液数滴于涂片上1分钟,水洗;(2)媒染:滴加碘液媒染1分钟,水洗;(3)脱色:滴加95%酒精,轻轻不断摇动玻片,使染液尽可能脱去,持续20~30s,水洗;(4)复染:滴加稀释石炭酸复红染液数滴于涂片上复染1分钟,水洗。吸水纸吸干,油镜观察。细菌呈现第一次染色的效果紫色，革兰氏阳性菌（紫阳G+）呈现第二次染色的效果红色；称革兰氏阴性菌（红阴G-）G+菌:金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、甲型和乙型链球菌、枯草杆菌G-菌:大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、卡他双球菌、淋球菌等四、注意事项：1、选用培养18～24小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。2、加热固定时要使用载玻片夹子，以免烫伤。不要将载玻片在火焰上烧烤时间过长，以免载玻片破裂。3、革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。因此必须严格把握脱色时间。4、使用染料时注意避免沾到衣物上，乙醇脱色时勿靠近火焰。