生物质谱

第七章生物质谱第一节生物质谱发展过程质谱分析法(massspectrometry)将化合物形成离子和碎片离子，按其质荷比(Ｍ/Ｚ值)的不同进行分离测定，来进行成分和结构分析的一种分析方法。用于分析生物大分子的质谱技术成为生物质谱。Conventionalmassspectrometersusedforlowvolatilemolecularweightsamplesthatareintroducedinthevaporphasearecalledsingle-focusingmassspectrometers.•20世纪60年代质谱技术在有机化合物小分子的结构测定中得到应用，而对于大分子(分子量超过1000Da)、极性分子和难气化的分子，则显得无能为力。70年代Macfarlane等人发明了一种被称作等离子体解吸(Plasmadesorption,PD)的离子化技术，使得质谱测定分子量范围扩大到几千道尔顿。80年代初Barber等人又引入了快原子轰击(fastatombombardment，简称FAB)电离技术，并成功地测定了一个26肽的结构，从而使得质谱技术应用于蛋白质和肽的结构测定这一设想变为现实。•80年代末JohnFenn发明的电喷雾电离(electrosprayionization，ESI)和Hillenkamp等人发明的基质辅助激光解吸电离(matrixassistedlaserdesorptionionization,MALDI)。使质谱分析生物大分子成为可能。第二节生物质谱仪及其相关技术2.1质谱仪组成质谱仪由以下四部分组成：•进样系统——按电离方式的需要，将样品送入离子源的适当部位；•离子源——用来使样品分子电离生成离子，并使生成的离子会聚成有一定能量和几何形状的离子束；•质量分析器——利用电磁场（包括磁场、磁场和电场的组合、高频电场和高频脉冲电场等）的作用将来自离子源的离子束中不同质荷比的离子按空间位置，时间先后或运动轨道稳定与否等形式进行分离；•检测器——用来接受、检测和记录被分离后的离子信号。2.2离子源•离子源的功能是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大，因此，对于不同的分子应选择不同的离解方法。•给样品较大能量的电离方法为硬电离方法，而给样品较小能量的电离方法为软电离方法，后一种方法适用于不稳定或易电离的样品。2.2.1离子源类型•电子轰击电离(ElectronImpactIonization，EI)•化学离子化(ChemicalIonization，CI)•场电离，场解吸(FieldIonizationFD，FieldDesorptionFD)•快原子轰击(FastAtomBombardment，FAB)•电喷雾电离(ElectrosprayIonization，ESI)•基质辅助激光解析电离(Matrix-AssistedLaserDesorptionIonization，MALDI)•大气压化学电离(AtmosphericPressureChemicalIonization，APCI)常用的适用于生物大分子研究的质谱技术方法包括FAB-MS、ESI-MS、MALDI-TOF-MS等，而其中又以ESI-MS和MALDI-TOF-MS应用最为广泛，这两个新技术明显增加了质谱范围和敏感度，从而导致了新的软件和检测器的发展。电喷雾离子化技术（electrosprayionization，ESI）原理：在一个金属喷嘴的尖上加有2.5～6kV高电压，经强电场作用，样品溶液从针尖小孔喷出，成为一个个带正电的液滴。在迎面吹来的热氮气流的作用下，液滴表面溶剂蒸发，液滴变小，液滴的电荷密度骤增。当静电排斥力等于液滴的表面张力时，液滴便发生崩解(库仑爆炸)，形成更小的液滴。如此形成的小液滴以类似的方式继续崩解，于是，液滴中的溶剂迅速蒸干，产生多电荷正离子，在质谱仪内被分析纪录。RayleighLimitReached++++++++++-----++++++++++-----++++++--++++++--Evaporation++ChargedDroplets试样离子准分子离子++++++++--其他离子ESI-MSThehollowstainlesssteelneedleismaintainedatafewkilovolts(kV)relativetothechamberwallsandthecylindricalcathodesurroundingit.Theliquidsampleentersatarateof1–20μL/minthroughtheneedle,butlowerflowrates(10–100nL/min)arebecomingmorecommoninmoderninstrumentation.TheelectricfieldattheneedletipdispersestheliquidbyCoulombicforcesintoafinesprayofchargeddroplets.Thesedropletsmigrateinthefieldtowardtheglasscapillaryinlet.Aflowofdryinggas(typicallyN2at100mL/s)evaporatesthesolventfromthedroplets,sothattheirdiameterdecreases,andthesurfacechargedensityoneachdropletincreases.WhenthissurfacechargedensityreachestheRayleighlimit,theCoulombicrepulsionisapproximatelyequaltothesurfacetension,andthedropletexplodesintosmallerdroplets.这种分子离子特点是带多个电荷。这些离子的形成是靠吸附上或失去若干个质子而形成，所以在正离子或负离子谱上会观察到(M+nH)n+或(M-nH)n-的峰。对于生物大分子，在ESI谱上出来的往往是一组带不同电荷的分子离子峰，根据仪器上记录下来的每个峰的质荷比及电荷数即可算出分子量值。ESI-MS优缺点•优点：解决了极性大、热不稳定的蛋白质与多肽分子的离子化和大分子质量、一级结构和共价修饰位点的测定问题。•缺点：样品中的盐类对样品结果影响很大，而且单个分子带电荷不同可形成多种离子分子峰（重叠峰），所以对混合物的图谱解析比较困难。基质辅助激光解析电离(MALDI)•待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团的化学基质(matrix)混合，此样品混合物随即滴于一平板或载玻片上进行挥发，样品混合物残余水份和溶剂的挥发使样品整合于格状晶体中，样品然后置于激光离子发生器(lasersource)。激光作用于样品混合物，使化学基质吸收光子而被激活。此激活产生的能量作用于生物大分子（多肽），使之由固态样品混合物变成气态。由于多肽倾向于吸收单一光子，故多肽离子带单一电荷.这些形成的多肽离子直接进入飞行时间质量分析仪(TOFmassanalyzer)。飞行时间质量分析仪用于测量多肽离子由分析仪的一端飞抵另一端探测器所需要的时间。TOF质量分析器被认为是与MALDI的最佳搭配。MALDI-TOF-MSMALDI-MS特点•对于一些分子量较大或疏水性强的蛋白质，MALDI比ESI更有效。•MALDI能有效地分析较复杂的肽混合物或物理化学性质相差较大的蛋白质混合物。只要能与所选择的底物形成稳定的分散体系的样品都能用MALDI进行分析。•MALDI不受样品所含的添加物、缓冲液或盐的影响，且灵敏度也比别的离子化方式高。Yes±0.005%-0.01%to50kDA±0.02%-0.03%to150kDA≤150kDALowtolerance(≤20mM)fornonvolatilebuffers,alkalimetalsalts,detergents;onlineLC-MSusedforcontaminantremovalESINo±0.01%-0.05%to25kDA±0.05%-0.3%to300kDA≥350kDAHightolerance(≥50mM)foralkalimetalsalts,phosphate,urea,etc.;tolerantofsomenonionicdetergents;intolerantofSDSMALDICompatiblewithon-lineLC/CE-MSMassassignmentaccuracyMWrangeToleranceforbuffers,salts,anddetergentsIonizationmethod生物质谱两种主要电离方法比较2.3质量分析器•质量分析器能将带电离子根据其质荷比加以分离，•质量分析器的主要技术参数是：质荷比的范围（质量范围）和分辨率。•质量分析器类型：扇形磁分析器，四极杆分析器离子阱分析器，飞行时间分析器傅里叶变换分析器四极杆分析器•离子束在与棒状电极平行的轴上聚焦，一个直流固定电压（DC）和一个射频电压（RF）作用在棒状电极上，两对电极之间的电位相反。对于给定的直流和射频电压，特定质荷比的离子在轴向稳定运动，其他质荷比的离子则与电极碰撞湮灭。•Thequadrupoleanalyzer(ormassfilter)isformedbyfourmetalrods(usuallyhigh-gradesteel),positionedpreciselyineachcornerofanimaginarysquare.•Betweendiagonallyopposedrodsadirectcurrent(dc)voltageisapplied,withasuperimposedradiofrequency(rf)alternatingfield.Bothdcandrfvoltagesarescanned.Iontrajectoriesacrossthequadrupolearecomplicated.Undergivenconditionsofdcandrf,ionsofonlyonem/zvaluewillreachthedetector.Allotherm/zionspossessunstablepathsthatimpactontherods.三级四极杆质量分析器离子阱分析器•由两个端盖电极和位于它们之间的类似四极杆的环电极构成。端盖电极施加直流电压或接地，环电极施加射频电压（RF），通过施加适当电压就可以形成一个势能阱（离子阱）。根据RF电压的大小，离子阱就可捕获某一质量范围的离子。离子阱可以储存离子，待离子累积到一定数量后，升高环电极上的RF电压，离子按质量从高到低的次序依次离开离子阱，被电子倍增监测器检测。飞行时间分析器•有相同动能，不同质量的离子，因其飞行速度不同而分离。如果固定离子飞行距离，则不同质量离子的飞行时间不同，质量小的离子飞行时间短而首先到达检测器。各种离子的飞行时间与质荷比的平方根成正比。•Timeofflightanalyzers(TOF)allowionstomoveacrossavacuumtube(usuallynamedflighttube).IonsaregenerallyproducedbyMALDIorbyanothertechniquecapableofproducingdiscreteburstsofions.About100–500nsafterthelaserpulse,astrongaccelerationfieldisswitchedon,andthisimpartsafixedkineticenergytotheions.Astheionstravelacrossthevacuumtube,ionswithlowm/ztravelfas