实验一 细胞形态多样性及细胞计数

【实验目的】了解培养中的动物细胞的一般形态和生长状态；掌握细胞计数的基本方法。实验一细胞的形态观察和细胞计数【实验原理】1、细胞形态观察根据体外培养细胞在培养时，是否能贴附于支持物上生长，可将其分为贴附型生长细胞和悬浮型生长细胞两大类。贴附型细胞在培养时能贴附在支技物表面生长，一般有两种形状，即表现为成纤维型细胞和上皮细胞生长。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。大多数细胞是贴附型生长的。当细胞贴附在支持物上后，细胞的形态失去它们在体内时的原有特征，在形态上表现单一化的现象。此细胞形态与体内成纤维细胞的相似而得名，胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质向外伸出２～３个长短不齐的突起。细胞在生长时呈放射状火焰状或旋涡状走行，除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织细胞常呈此形态。成纤维细胞型上皮细胞型本型细胞呈扁平不规则多角形，中有圆形核。细胞彼此紧密相连成单层膜，生长时呈膜状移动；处于上皮膜边缘的细胞总与膜相连，很少脱离细胞群单独活动；起源于内、外胚层细胞如皮肤表层、消化层上皮、肝、胰、肺泡上皮等皆呈上皮型形态。此型细胞在支持物上散在生长，一般不连接成片，细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动。此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞相区别，在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它们也可能呈成纤维细胞形态。游走细胞型有一些组织和细胞，如神经组织的细胞等，难以确定他们规律和稳定的形态，可通归入多形细胞型。多形细胞型悬浮型有的细胞在培养时不粘附于支持物上,而是呈悬浮生长状态,如某些癌细胞和血液白细胞。细胞悬浮生长时胞体为圆形。细胞悬浮培养的优点是细胞生存空间大,生长时间长,能繁殖出大量细胞。培养细胞形态的分类,主要是根据细胞在培养中的表现以及描述上的方便而定。它可受很多因素的影响而发生变化。当细胞处于较好的培养条件时,形态上有相对的一致性,在一定的程度上能反映细胞的起源以及正常和异常的区别。但培养条件是很难控制的，难免不发生变化。如CO2浓度，培养液的PH,支原体的产生,包括细胞接种密度等,都会影响细胞形态。悬浮型和贴附型的性质也不是一成不变的。在一定条件下,悬浮型细胞可呈贴附状生长。由于培养细胞形态的易变性,在利用形态学指标判定细胞类型和其它一些变化时,应参考多方面指标,必要时应利用电镜来提供形态学依据。sp2/01.细胞种类：小鼠骨髓瘤细胞2.培养的天数：复苏后12小时；3.放大倍速：倒置显微镜X20；4.培养基种类：DMEM+6%FBS；5.细胞状态与特征简述:细胞呈圆型或椭圆形。培养细胞形态分析贴壁细胞在生长状态良好时，胞体细长、胞浆清亮，细胞内颗粒少，看不到有空泡，细胞边缘清楚，细胞长成单层时呈漩涡状排列；悬浮细胞当表现出边缘清楚，透明发亮时，生长较好；反之，则较差或已死亡。在细胞机能状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大；细胞内颗粒较多，透明差，空泡多。若细胞胞体肥大、胞浆内混浊、颗粒增多、折光性下降、变扁平透明，细胞核明显增大、细胞排列极不规则则，细胞可能已经衰老。培养基内有pH指示剂的存在，因此它的颜色往往可以间接地表明细胞的生长状态。呈橙黄色时，细胞一般生长状态较好；呈淡黄色时，则可能是培养时问过长，营养不足，死亡细胞过多；如呈紫红色，则可能是细胞生长状态不好，或已死亡。当细胞生长状态良好时，培养液应清澈透明，悬浮的细胞和碎片很少。当瓶内培养基混浊时，应想到细菌真菌污染的可能。实际上，一种细胞在培养中的形态并不是永恒不变的，它随营养、pH、生长周期而改变，但在比较稳定的条件下形态基本是一致的。在贴壁细胞培养中，镜下折光率高，圆而发亮的一般被认为是分裂期细胞。肿瘤细胞有重叠生长的特征。1、细胞形态观察（l）将细胞培养瓶从37℃二氧化碳培养箱(或温箱)中取出，注意观察细胞培养液的颜色和清澈度，然后，将细胞培养瓶平稳地放在倒置显微镜载物台上，此时应注意不要将瓶翻转，也不要让瓶内的液体接触瓶塞或流出瓶口。（2）打开倒置镜光源，通过双筒目镜将视野调到合适的亮度。（3）调节粗调旋钮调整物镜的高度进行对焦，在看到细胞层之后，再用细调节器将物像调清楚，注意观察细胞的轮廓、形状和内部结构，在观察时，最经常使用的是10X物镜。【实验内容】细胞形态多样性及细胞计数一.实验原理当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中的细胞数目。1.血球计数板的构造血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的。玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面个刻有一个方格网。方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供计数用。这一大方格的长和宽各为1mm，深度0.1mm为，其体积为0.1mm3。Volume=1mmx1mmx0.1mm=0.1mm3=1x10-4cm3=1x10-4mL若该体积内有n个细胞则，則细胞浓度为=n個/(1x10-4mL)=nx104個/mL(若有稀释再乘以稀释倍数)常使用計數ABCD四區域有n個細胞，則細胞濃度為=n/4x104（個/mL）細胞計數時，細胞濃度不要太稀，太稀準確度會比較低，最好在1～3x106個/mL1mm1mmHemocytometer(血球計數器)ABCD由此滴加樣本二.试剂与器械器材:光学显微镜、血细胞计数板。三．实验步骤1.取血细胞计数板，加盖玻片盖住两边的小槽。2.充液：用小滴管将一小滴稀释悬液滴在盖玻片边缘的玻片上，使稀释液借毛细管现象自动渗透入计数室中。如滴入过多，溢出并流入两侧槽内，使盖玻片浮起，体积改变，会影响计数结果，需用滤纸把多余的溶液吸出，以槽内没有溶液为宜。如滴入溶液过少，经多次充液，易产生气泡，应洗净计数室，干燥后重做。3.计数：充液后静止1-2分钟，待细胞下沉后，方可进行计数。计数四角及中央共5个中方格内的20个小方格中所有红细胞数，计数时为了防止重复和遗漏，应按一定的顺序，先自左向右数到最后一格，下一行格子则自右向左，再下一行又自左向右，即呈S形计数。对于分布在刻线上的红细胞，依照“数上不数下，数左不数右“的原则进行计数。计数时，如发现各中方格的细胞数目相差20个以上，表示细胞分布不均匀，必须重新计数。四.注意事项防止液体滴入过多，否则溢出并流入两侧槽内，会使盖玻片浮起，体积改变，会影响计数结果。五.实验结果血球计数板的清洁血球汁数板使用后，用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹风机吹干，或用95％的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复清洗直到干净为止。