第五节转录后加工

第五节转录后加工RNAProcessing•VeryfewRNAmoleculesaretranscribeddirectlyintothefinalmatureRNA.•MostnewlytranscribedRNAmolecules(primarytranscripts)undergovariousalterationstoyieldthematureproduct•RNAprocessingisthecollectivetermusedtodescribethemoleculareventsallowingtheprimarytranscriptstobecomethematureRNA.primarytranscriptprimarytranscriptmatureRNAmatureRNANucleusorNucleolusCytoplasmRNAprocessingRemovalofnucleotidesadditionofnucleotidestothe5’-or3’-endsmodificationofcertainnucleotides转录后的加工（posttranscriptionalmodification）（1）减少部分片段：如切除5′端前导序列，3′端拖尾序列和中部的内含子；（2）增加部分片段：5′加帽，3′加poly(A),归巢和通过编辑加入一些碱基；（3）修饰：对某些碱基进行甲基化等。一、tRNA和rRNA的加工一.原核的tRNA和rRNA的加工参与蛋白质合成的tRNA和rRNA都不是最初的转录产物(1)它们的5′端都是单磷酸，而原始的转录产物5′应是三磷酸；(2)分子比初始转录物小；(3)tRNA含有特殊的碱基，这些碱基只有通过一些化学修饰才可以得到。表13-1E.coli中含有的小分子核酸酶酶基因底物功能RNasePrnpAtRNA5′端内切RnaseOrnpBRnaseBN?tRNA3′端外切RnaseDrndtRNA3′端外切RnaseT?tRNA3′CCA外切RnaseⅢrncrRNA和mRNA内切RnaseR?rRNA和mRNA外切RnaseErne5SrRNA内切RnaseⅠrna大部分RNA内切RnaseⅡrnbRNA外切多核苷酸磷酸化酶pnpRNA外切RnaseHrnhRNA-DNA杂合链内切(一)tRNA的加工•原核的tRNA初始转录本多为多顺反子，即几个tRNA分子串连在一起；•前体tRNA通常含有前导序列（41nt）和尾随序列（224nt）tRNA的加工分3个阶段•“斩头”：形成5′末端；•去尾：形成3′-OH末端。缺-CCA的tRNA要用tRNA核酸转移酶加-CCA。•修饰：通过甲基化酶、硫醇酶、假尿嘧啶核苷化酶等进行修饰，如氨基酸臂的4-硫尿苷（4tu），D臂的2甲基鸟苷（2mG），TψC臂的假尿苷（ψ）和反密码子环上的2异戊腺苷（2ipA)MaturetRNAtRNAprocessinginprokaryotesMaturetRNAsaregeneratedbyprocessinglongerpre-tRNAtranscripts,whichinvolves:1.specificexo-andendonucleolyticcleavagebyRNasesD,E,FandP(general)2.basemodificationswhichareuniquetoeachparticulartRNAtypeStepsintRNAprocessing150nt-OH3’5’p-1.Endo-nucleaseE/F2.RNaseD3.RNaseP(remove28bp)4.RNaseDD-loopT-loopAnticodonloopCCA真核tRNA的基因和原核不同(1)真核的前体分子tRNA是单顺反子，但成簇排列，基因间有间隔区；(2)真核tRNA基因一般都比原核tRNA基因多得多，如酵母约有400个tRNA基因；(3)5′端单磷酸核苷酸，表明已被加工过；(4)tRNA的前体分子中含有内含子。真核tRNA内含子的特点①位置相同，都在反密码子环的下游；②不同tRNA的内含子长度和序列各异；③外显子和内含子交界处无保守序列；④内含子的剪切是依靠RNase异体催化；⑤内含子和反密码子配对形成茎环。有何意义？成熟的tRNA前体tRNACGGAAUGCmAYmCAUYGAA反密码子酵母tRNAPhe内含子的结构CGGAAUGCmAYCGAUCUGGCAUAUGCAAAAAAUUAGAGAUC真核tRNA内含子切除的特点(1)没有交界序列，也没有内部引导序列；(2)剪切反应的信号是二级结构，而不是一级结构；(3)是依赖于蛋白质性质的RNase，而不是核糖拟酶或snRNP；(4)反应的本质不是转酯反应。加野生型酵母细胞提取物凝胶电泳前体tRNA内含子图13-酵母tRNA在体外的剪切酵母tRNA前体内含子3’和5’端的剪切是由内切酶的不同亚基催化的。亚基Sen34,Sen2剪切3’端和5’端.Sen54可能通过量度成熟结构域的距离来决定5’端剪切位点的位置。A1碱基对也是重要的。3’3’3’3’5’核酸酶5’折叠5’连接5’OH5’3’OH5’OH2’－3’P2’－3’PtRNA链O碱基O碱基OHPCH2O碱基CH2O碱基OOOHOPOPOOHOHOOOtRNA链tRNA链2’－3’环磷酸3’－OH,2’磷酸环磷酸二酯酶打开2′-3′环磷酸激酶使5′-OH磷酸化连接酶酵母tRNA的加工主要分为两步：切除内含子、连接外显子YeasttRNATyr古细菌tRNA用于剪切的核酸内切酶在每个“突起－螺旋－突起”片段的突起处切割每条链真核tRNA的加工和原核的区别(1)真核tRNA前体中无二聚体和多聚体；(2)增加了剪接内含子的过程；(3)都要加CCA（机制不明）。(二)rRNA的加工tRNAIletRNAAlatRNAAsptRNATrp16S23S5SRNaseIIIRNaseIIIRNaseIIIRNaseIIIRNaseRRNaseRRNaseRRNaseRRNaseR图13-rRNA的加工（原核）真核细胞中rRNA的加工途径(1)切除5′端的前导序列；(2)从41S的中间产物中先切下18S的片段。Hela细胞的切点在18S和5.8S之间的ITS（内部转录间隔序列）；L细胞的切点在18S序列和ITS的交界处，称为先成熟。(3)部分退火，形成发夹结构；(4)最后修正。剪切位点5’3’18S5.8S28S人类HeLa细胞途径：小鼠L细胞途径：45S41S41S32S36S20S18S18S32S28S－5.8S28S－5.8S二、前体mRNA的加工•mRNA前体分子的加工主要是真核mRNA，原核的mRNA一般不经过加工。•真核mRNA的加工一般要经过四步：(1)5′加帽；(2)3′加尾；(3)切除内含子；(4)修饰：对某些碱基进行甲基化。（一）原核生物mRNA的加工P早期转录基因A1A2A30.30.711.11.21.3tRNaseⅢpppPuCoHpppPu前导序列0.30.711.1/1.21.3mRNA图13-T7噬菌体早期区转录单条前体RNA，经RNaseⅢ剪切成5条成熟的mRNA原核生物的mRNA很少经过加工，但在少数情况下多顺反mRNA先被内切核酸酶切成较小的单位再成为翻译的模板AUGCCGCUACGGUCGUGCGGCAUAUCUUAURNaseⅢCGAAGUAUUAAUGCUA0.3mRNAGC0.7mRNAAUGUGAAUCUGCUCUACUUAUGAG图13-RNaseⅢ在T7茎环上的典型切割位点(GENESVIFig12.47)切点在不配对的泡上E．coli90’/100’处rplJ(L10)rplJ(L10)rpoB(β亚基)rpoC(β’亚基)转录前体多顺反子mRNARNaseⅢ加工成熟的mRNAE.Coli89～90操纵子的转录加工（二）真核mRNA前体的加工(一)核内不均一RNA(heterogenousnuclearRNA,hnRNA）•平均分子长度为8-10Kb(2Kb~14Kb)左右。比mRNA的平均长度（1.8-2Kb）要大4-5倍。•hnRNA仅有总量的1/2转移到细胞质内，其余的都在核内被降解掉。•hnRNA是mRNA的前体，证据是：(1)hnRNA和mRNA有相同的序列；(2)hnRNA在体外能作为模板翻译蛋白；(3)两者5′端都有帽子结构；(4)二者为相同的聚合酶所合成（对放线菌素D的反一致）；(5)两者的3′端都有多聚腺苷尾巴。hnRNA的结构的特点•5′端有帽结构；•3′端有poly（A）尾巴；•帽结构后有3个寡聚U区，每个长约30nt；•有重复序列，位于寡聚U区后面；•有茎环结构，可能分布于编码区（非重复序列）的两侧；•非重复序列中有内含子区。5’m7pppNmNUUUUAAAAA……3’寡聚U区ds单一序列dsPoly(A)RNARNA图13-hnRNA的结构模型hnRNP:hnRNA+proteins•ThehnRNAssynthesizedbyRNAPolIIismainlypre-mRNAandrapidlybecomescoveredbyproteinstoformheterogeneousnuclearribonucleoproteins(hnRNPs),30-40S•ThehnRNPproteinsarethoughttohelpkeepthehnRNAinasingle-strandedformandtoassistinthevariousRNAprocessingreactionshnRNA的物理结构是核糖核蛋白颗粒（hnRNP）,颗粒中蛋白质包围着hnRNA。体外研究表明hnRNA的形状是一个球体和一个与之相连的纤维状结构。在细胞核中，RNA加工包括3‘端和5’端修饰以及内含子的去除等。剪切需要在内含子与外显子交界处产生断裂，然后将外显子末端连接。成熟的mRNA通过核孔被运到细胞质中，在那里它完成翻译。1．加帽(1)剪接前加帽如呼肠病毒、牛痘病毒(2)剪切后加帽如疱疹病毒、口炎病毒GN1N2N3GN1N2N3磷酸水解酶PPPPPPP…PPPPPP…＋PiGN1N2N3GmRNA鸟苷脱酰转移酶PPPPPP…＋PPPOH加帽酶GGN1N2N3甲酰基转移酶OHPPPPPPP…＋PPi(S-腺苷甲硫氨酸，AdoMet)7mGmGmN1N2N3OHPPPPPPP…图13-真核生物剪切前加帽的生化反应过程7－甲基鸟苷三磷酸GN1N2N3N1N2N3PPPP…PPPP…PPPP…GN1N2N3GN1N2N3＋＋PiPPPOHPPPP…PPPPPPP…GN1N2N3SAM7mGN1N2N3PPPPPPP…PPPPPPP…图13-真核生物剪切后加帽的生化反应过程帽子的类型•在5’末端鸟苷的第7位上存在单个甲基化位点的称0型帽子（cap0）；•在5’次末端核苷酸的核糖上的2′-O位点上还有一个甲基位点的称1型帽子(cap1)；•此外，在第三个核苷酸的核糖上（2′-O）有甲基化位点的称2型帽子（cap2）；•这三种帽子都有特殊面对面核苷酸结构（confrontdenucleotidestructure，与下一个核苷酸以5‘与5’相对的方式连接）。三种帽子的共同在帽1中可被甲基化NH2位置CNOCH3NCCHCNHCCHNCNNCHOCOOO2HNNNCH2OPOPOPOCHOOO帽1位置OCH3OOPOCH2O帽2位置OCH3OOPOO图13-mRNA5’端的帽子位置和可被甲基化的位点“帽子”的功能•有助于mRNA越过核膜，进入胞质；•保护5′不被酶降解；•翻译时供IFⅢ（起始因子）和核糖体识别。2加尾•CPSF(cleavageandpolyadenylationspecificityfactor剪切和多聚腺苷酸化特异因子)–识别AAUAAA（加尾信号）•CF（剪切因子）在加尾位点AAUAAA下游11－30nt处剪切RNA；