慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒系统介绍

慢病毒、腺病毒、腺相关病毒（AAV）、逆转录病毒系统介绍汉恒生物提供四大病毒包装服务随着病毒生物学的发展，种类繁多的病毒载体已越来越成为向各种实验系统（如细胞系、原代细胞、组织脏器等）转运核酸的重要工具。除了在实验室的组织培养和动物模型生产中发挥重要作用，它们还被用于治疗遗传性疾病的临床试验中。目前主流的病毒载体系统主要包括慢病毒（LV）、（γ-）逆转录病毒（RV）、腺病毒（Ad）和腺相关病毒（AAV）。我们分述之。慢病毒和逆转录病毒均属于逆转录病毒科。其典型特征为其RNA基因组能逆转录为cDNA副本，cDNA副本又能稳定整合至宿主细胞基因组中（这就是常说的稳转）。逆转录病毒通常分两种：简单的（有时又称为致癌病毒或γ-逆转录病毒，如鼠白血病病毒）和复杂的（如慢病毒）。这些亚型间主要的差异在于复杂的逆转录病毒存在一些附属基因和调控基因，而简单的则没有（下文有进一步的讨论）。这两类病毒颗粒都含有两份正链RNA，RNA上附有病毒反转录酶（RT），它们位于病毒的内核（图1）。位于内核的还有结构蛋白和酶，包括核壳（NC）、衣壳（CA）、整合酶（IN）和蛋白酶（PR）。内核由一圈外周蛋白层包围，外周蛋白包括基质蛋白（MA），基质蛋白又被来源于宿主细胞细胞膜插有包膜糖蛋白的腹膜所包围。图1.简单和复杂逆转录病毒粒子结构。病毒颗粒含有两份正链RNA，RNA上附有反转录酶（RT），它们位于病毒的内核。除此之外，内核还包含核壳（NC）、衣壳（CA）、整合酶（IN）和蛋白酶（PR）。内核由一圈基质蛋白（MA）所包围，基质蛋白又被来源于宿主细胞细胞膜插有包膜糖蛋白（ENV）的腹膜所包围。图片来源：汉恒生物组织整理。实验室常用的慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷1型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。具有感染谱广泛、可以有效感染分裂期和静止期细胞、长期稳定表达外源基因等优点，因此成为导入外源基因的有力工具。现在慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA干扰、microRNA研究以及活体动物实验中。在整合宿主基因组过程中，逆转录病毒（比如MLV）通常大约20%的感染事件发生在转录单位的5'端，对CpG岛和DNaseI超敏感位点附近有一定的倾向性。而慢病毒载体多整合到远离转录起始点的位点。因此，与逆转录病毒载体相比，慢病毒载体似乎致癌可能性较低，临床应用可能更安全。重组腺病毒（Adenovirus，Ad）载体系统是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。重组腺病毒具有以下几个显著的优点：感染范围广，几乎可以感染所有的细胞系、原代细胞和部分组织；感染效率高达100%，全面超越其他病毒载体工具和脂质体转染；对外源基因容载能力大（可以高达8Kb）；不整合基因组；滴度高，操作方便。因此，重组腺病毒是最具有潜力的一种基因递送工具。目前常用的腺病毒载体是基于人腺病毒5型（Ad5）的，其基因组是36Kb长的线性双链DNA。腺病毒是通过自身的纤维（Fiber）和细胞表面的受体（如CAR）结合被内吞进入细胞，然后从内吞体（endosome）转移到细胞质和细胞核内，借助细胞的转录和翻译机器启动病毒的复制组装(图2)。一个完整的病毒生活周期会引发细胞死亡从而释放出病毒粒子。图2.腺病毒的基结构与感染过程。图片来源：汉恒生物组织整理。目前最常用的腺病毒包装体系有AdEasy和AdMAX两种，其共同特点是目的基因（GOI）首先克隆到穿梭载体，然后再重组到腺病毒的大骨架上。这两个系统均是腺病毒早期转录复制基因E1和E3缺陷的(E1,E3)，其中E3基因对病毒产生并非必需。因此，腺病毒包装必需依赖表达E1的细胞系，比如HEK-293，HEK-293A等。腺相关病毒（Adeno-AssociatedViralVector，AAV）属微小病毒科(parvovirus)，为无包膜的单链线状DNA病毒。只有在腺病毒或者疱疹病毒等辅助病毒协助下，宿主才能产生具有感染性的AAV，所以AAV被称作腺相关病毒。典型的AAV2基因组约4800bp的单链DNA-被二十面体的外壳-Capsid包裹。AAV的基因组包括2个反向末端重复序列(ITR，145bp)和两个读码框(ORF)-Rep和Cap（图1）。ITR对合成互补DNA链是必需的；Rep和Cap可以翻译成多种不同蛋白，如AAV生活周期必需的Rep78、Rep68、Rep52和Rep40以及包膜蛋白VP1、VP2及VP3等。图3.AAV基因组结构与Capsid（Cap）高频突变位点示意图。A.Capsid晶体结构示意图。其中蛋白VP1表面不同颜色的氨基酸基团代表Cap高频突变位点。B.Cap基因结构。其中CapORF编码3个蛋白-VP1、VP2和VP3。高频突变区域用不同颜色的箭头表示，并对应到图A中Cap表面不同颜色的氨基酸基团。C.AAV基因组结构。图片来源：汉恒生物组织整理。需要着重提及的是，Capsid表面一些关键的氨基酸残基（图1A中不同颜色的氨基酸）会与细胞表面的受体相互作用，介导AAV病毒的特异性感染到目的组织或脏器。目前AAV有12种血清型、100多种变体。不同的血清型对组织或器官有着不同的亲和性（图4）。由于安全性高、免疫原性小、表达周期久等优点，AAV被称为目前最适合在体研究（invivo）基因功能的利器。图4.不同的AAV血清型对组织或脏器的偏爱性。图片来源：汉恒生物组织整理。我们综合比较下四种病毒载体系统的特点（表1）：病毒表达系统腺病毒表达系统慢病毒表达系统逆转录病毒腺相关病毒病毒基因组dsDNAssRNAssRNA病毒ssDNA是否整合不整合随机整合并稳定遗传随机整合并稳定遗传不整合感染细胞类型感染分裂和不分裂细胞感染分裂和不分裂细胞感染分裂细胞，但在干细胞中表达效率低感染分裂和不分裂细胞表达丰度及速度高水平表达,细胞水平36hr可达到高峰，在体水平约72hr达到高峰高水平表达，细胞水平72hr达到稳定，在体水平表达较差，约需要96hr表达高水平表达，细胞水平72hr表达，在体一般不采用低水平表达，细胞水平需要表达7天左右，动物水平需要表达2周维持表达时间3周稳定表达稳定表达，有被silence的风险稳定表达6月以上滴度1011PFU/ml108TU/ml107TU/ml1012v.g./ml克隆容量高达5.5kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低不超过4kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低不超过3kb的外源片段不超过2kb的外源片段感染细胞适合适合分裂型细胞AAV-DJ比较适合，其他血清型表达效率弱动物实验适合滴度低，效率低效率最低非常适合免疫原性高免疫原性中免疫原性中免疫原性极低免疫原性表1.四种主流病毒载体系统的特点比较。图表来源：汉恒生物组织整理。