慢病毒包装试剂盒说明书

YRGene慢病毒包装试剂盒说明书产品编号：LPK010产品规格：10个10cm皿产品简介：赢润生物的慢病毒包装试剂盒包括如下成分：（1）优化配比的慢病毒包装辅助质粒混合物，可兼容大多数慢病毒表达载体。（2）高效转染试剂（InvitrogenLip2000原装产品分装，293T细胞转染效率接近100%）。（3）高效率的慢病毒浓缩液，无需超速离心，也不需要价格昂贵的过滤柱，快速富集病毒粒子，其优势在于操作安全简单，对设备要求低，产毒效率高，能够快速、高效地收获高滴度病毒。产品组成：慢病毒包装步骤：1.转染前，传代293FT细胞于10cm培养皿中（例如，接种1×107细胞于10cm培养皿中，使用完全培养基DMEM+10%FBS培养），当细胞密度能够达到90-95%即可进行转染。Tips：培养基里面不要添加抗生素。2.转染前1-3小时，更换培养基，加入7ml新鲜的完全培养基（DMEM+10%FBS），注意不要添加抗生素。3.准备转染。在5ml离心管中，分别配制A管与B管试剂（TubeAandTubeB）TubeATubeBOpti-MEMIMedium1.5mlOpti-MEMIMedium1.5mlYRGeneLentiviralMix20ulLip200030ul慢病毒表达载体（客户自行准备，大提质粒）10ug配好后，放置5min，然后将A管缓慢加入B管，混合均匀。室温放置20min，使得脂质体-DNA混合物形成。Tips：混合后可能会出现淡淡的乳白状，不会影响转染。然后将混合液逐滴均匀加入10cm培养皿，轻微混匀。置于37℃，5%CO2培养箱中培养过夜。4.第三天，更换培养基，加入10ml的完全培养基，同样注意不要加抗生素。5.转染后48-72h后收取上清，转移至15ml离心管。产品名称规格每平皿用量使用次数贮藏条件YRGeneLentiviralMix（包装质粒混合物）120ul15ul10~12次-20℃Lip2000转染试剂300ul30ul10次4℃ConcenSolution（慢病毒浓缩液）30ml3ml10~11次4℃Tips：上清里面含有病毒，请小心操作。6.3000rpm在4℃离心15min，去除沉淀。7.上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中。慢病毒浓缩：1.每10ml过滤后的病毒初始液，加入ConcenSolution3ml，每20-30min混合一次，共进行3-5次。2.4℃放置过夜。3.4℃，3000g，离心45min。4.去掉上清，静置管子1-2min，吸走残余液体。5.加入无血清DEME充分溶解慢病毒沉淀。6.病毒悬液分装成200μl每份,保存在离心管中，速冻后储存在-80℃。慢病毒滴度测定：进行慢病毒感染实验之前，我们强烈建议您进行慢病毒滴度检测。1.在滴定测定的前一天取48孔板，每孔接种3×104293FT细胞。2.加polybrene到新鲜的完全培养基中，使其终浓度为8μg/ml。3.加含有polybrene的完全培养基10倍稀释病毒。具体操作如下：取一个1.5ml离心管（或96孔板），加入90μl培养基和10μl待测病毒原液，混合均与后吸取10μl病毒混合液至第二个离心管（或96孔板第二个孔），混合时尽量不要产生气泡，如此稀释至第八个孔（即稀释105倍）。4.各取10μl病毒稀释液到对应的48孔中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养过夜，16h-24h后用新鲜的完全培养基换液。5.转染后72h，用荧光显微镜技术荧光细胞数量（如果观察不清晰可以先用PBS换液后再进行观察）。一般情况下，在最高稀释度10m的孔数出现N（N10）个带荧光的细胞，则病毒滴度为N×10mTU/ml（10m为稀释倍数），若N10，则需要继续稀释。注意事项：1.细胞的生长状态对于病毒包装至关重要，因此需保证良好的细胞生长状态和较少的细胞传代次数。2.病毒切勿反复冻融，如果实在需要冻融，次数尽量不要超过3次，每冻融一次大约有10%左右的病毒损失，应按照每次使用的病毒量来分装，保存于-80℃。保存时间尽量不要超过6个月。Titer1μl0.1μl0.01μl0.001μl0.0001μlVirusStock1010101010Mediumwith8μg/mlpolybrene9090909090Loadvolume1010101010Y