siRNA和miRNA简介

siRNA和miRNA简介20世纪50年代中期，人类发现生命的遗传物质是DNA双螺旋。这之后过了十多年，人们才发现了RNA，它们是联系DNA和蛋白质的“桥梁”，是细胞里的信使（信使RNA）、运输工具（转运RNA）和“车床”（核糖体RNA）上的关键零件，因此它们看起来好像一直在默默地干着一些替DNA跑腿的杂活。长久以来，生物学家们从来没有认为RNA会是生命中最重要的一份子。越来越多的证据清楚的表明，RNA在生命的进程中扮演的角色远比我们早前设想的更为重要。前言近些年来，人类发现了许多不同种类的RNA分子，其中最为重要的是小RNA分子的发现。有些小RNA分子能直接调控某些基因的开关从而控制细胞的生长发育并决定细胞分化的组织类型。在2002年度Science评选的10大科学成就中RNAi名列榜首。随着对小分子RNA研究的不断深入，研究人员开始认识到：小分子RNA的世界一点都不小。有人推测：小分子RNA可能代表一个新层次上的基因表达调控方式。RNA的分类细胞和和胞液线粒体功能核蛋白体RNArRNAmtrRNA核蛋白体组成成分信使RNAmRNAmtmRNA蛋白质合成模板转运RNAtRNAmttRNA转运氨基酸不均一核RNAhnRNA成熟mRNA的前体小核RNAsnRNA参与hnRNA的剪接、转运小胞浆RNAscRNA/7SL-RNA蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组成成分小RNA分子本身又包含了若干类RNA，根据小RNA的生成、结构和功能大约可分为以下几类：小干扰RNA（smallinterferingRNA;siRNA）和微小RNA（microRNA；miRNA）是两种序列特异性地转录后基因表达的调节因子，是小RNA的最主要组成部分，它们的相关性密切，既具有相似性，又具有差异性。对小RNA的深入研究将使我们更深一步了解生命的奥秘。概念：RNAinterference（RNAi）与靶基因序列同源的双链RNA所诱导一种序列特异性的转录后基因沉默现象。RNAi发现历程：1990年，曾有科学家给矮牵牛花插入一种催生红色素的基因，希望能够让花朵更鲜艳。但意想不到的事发生了：矮牵牛花完全褪色，花瓣变成了白色！??1995年康奈尔大学Guo等在对线虫C.elegans的研究中，应用正义链RNA作为对照，研究par-1基因的表达，意外的发现，正义链RNA与反义链RNA同样能够抑制目的基因的表达。1998年，AndrewFire等首次将正义链反义链RNA混合注入线虫C.elegans中，观察到更强的基因表达抑制。首次提出了RNAinterference的概念。Acontrol:notstainedB:wtC:wt+antisenseRNAD:wt+dsRNAMex-3mRNAdetectioninembryosbyinsituhybridizationRNAi机制DicerRISC碱基互补酶解short-interferingRNAQuickTime?andaGIFdecompressorareneededtoseethispicture.加工长链dsRNA形成21-23nt小片段DicercontainstwoRNAseIIIdomainssiRNAslongdsRNARISC:RNA-InducedSilencingComplexExonucleaseHomologysearchactivityEndonucleaseHelicase5’3’TargetmRNAOH3’5’P形成RISC复合物，降解目的mRNARNAi的生物学意义：一种古老、保守而又极其重要的遗传学行为。生物体在长期的进化过程中对异常基因活动的监控和防御,有学者称之为“基因组水平的免疫系统”。一种抗病毒感染机制。miRNA的研究起始于时序调控小RNA（stRNAs）。1993年，Lee等在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegan）中发现了第一个可时序调控胚胎后期发育的基因lin-4。2002年，Reinhart等又在线虫C.elegan中发现第二个异时性开关基因let-7。2001年10月《science》报道了三个实验室从线虫、果蝇和人体克隆的几十个类似C.elegan的lin-4的小RNA基因，称为microRNA。随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs。对一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，包括发育进程，造血过程，器官形成，凋亡，细胞增殖，甚至是肿瘤发生。WhataremicroRNAs？（1）miRNA是广泛存在于真核生物中的一组短小的、不编码蛋白质的RNA家族，它们是由19-25个核苷酸（nt）组成的单链RNA（3‘端可有1~2个碱基长度的变化）；miRNA的表达具有组织特异性和阶段特异性。即：在不同组织中表达有不同类型的miRNA,在生物发育的不同阶段里有不同的miRNA表达；编码miRNA的基因可位于基因组的非编码区，以及编码蛋白质基因的内含子、外显子和非翻译区。这些基因在基因组中成簇排列或分散排列。WhataremicroRNAs？（2）miRNA具有高度保守性，即各种miRNA都能在其他种系中找到同源体；miRNA独有的特征：其5＇端第一个碱基对U有强烈的倾向性，而对G却有抗性，但第二到第四个碱基缺乏U，一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏CmiRNA执行一定的生物学功能：对与其互补的mRNA表达水平具有调节作用；一些偏大的miRNA可能参与了基因组的重组装（27nt）；miRNA的成熟据体内外实验研究表明miRNA的生成至少需要两个步骤：1）由长的内源性转录本（pri-miRNA)生成70nt左右的miRNA前体（pre-miRNA)，该过程发生在细胞核;2)将pre-miRNA加工为成熟miRNA，该过程发生在细胞质中。Pre-miRNAPre-miRNA是由内源性基因间区或内含子的DNA反向重复序列转录而来,它是一种长约70nt的非编码RNA,具有茎-环结构也即发夹状结构。Pre-miRNA在Dicer的作用下可被剪切成miRNAmiRNA只是pre-miRNA茎中的一个臂miRNA与靶mRNA的作用模式：1）二者不完全互补，即二者不完全配对结合时，主要影响翻译过程（阻遏翻译）而对mRNA的稳定性无任何影响。这种miRNA是目前发现最多的种类。如线虫的lin-4。2）二者完全互补，即二者完全配对结合后，类似siRNA与靶mRNA的结合，特异性的切割mRNA。如miR39/miR171当miRNAs和编码蛋白质的mRNA几乎完全配对时，miRNAs诱导RNA介导（RNAi）的干扰途径。3）上述两种模式均具备。当其与靶mRNA完全互补配对时，直接靶向切割mRNA，而不完全互补配对时起调节基因翻译的作用。如let-7果蝇/线虫。miRNA的调控特点交叉调节：动物miRNA与靶mRNA之间的不完全配对使得任何一个miRNA都可能作用于不同的mRNA，一个mRNA也可能受到多个不同miRNA的调节。自我调节：自我调节参与了miRNA的生物合成和功能。例如,参与miRNA生物合成的一些酶也受到其产物miRNA的调节。Dcl1mRNA编码一种植物Dicer蛋白参与miRNA的生成,同时它也是miR2162的靶分子。可逆性调节：miRNA所致的翻译抑制在某些条件下是可逆的。当mRNA作为miRNA抑制的靶分子后,mRNA会被送至胞浆内的P体(Pbodies)重新定位。miRNA调节方式的优点与蛋白水平的调节相比，更加节省能量与转录水平调节相比，miRNA调节更迅速，而且是可逆的内含子所编码的miRNA是一种对基因组资源的高效利用microRNA基因组分布60%独立表达15%成簇表达25%的miRNAs位于内含子植物与动物miRNA的区别动物植物前体茎环结构短，简单长，复杂，折回长度变异明显加工过程作用机制先在细胞核，后在细胞质仅在细胞核中大部分作为翻译阻遏子，大部分介导靶mRNAs小部分导致靶mRNAs降解的降解长度保守性22-23nt高21nt更高经典理论：2008Nature小结miRNA的作用是多种多样的,它既可以通过关闭一些关键基因来改变细胞的命运，也可能与其靶基因产物相互作用形成调节环并与其他调节通路交织作用形成网络调控机制。大多数miRNA并非独立作用,而是参与到复杂的基因调控网络中。据推测,人类三分之一的mRNA都被miRNA调控,随着它们的作用机理逐步明了,相信将会给人类带来更多的福音。由于RNA病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因,细胞中出现了dsRNA（注：病毒入侵，或者是自身合成RNA中出现错误，细胞内就会产生双链RNA，来阻止这些异常基因的表达）。Rde-1(RNAi缺陷基因-1)编码的蛋白质识别外源dsRNA，当dsRNA达到一定量的时候，Rde-1引导dsRNA与Rde-1编码的Dicer酶（Dicer是一种RNaseIII活性核酸内切酶）结合，形成酶-dsRNA复合体。在Dicer酶的作用下，这些双链RNA被加工成20-25nt的siRNA，而后这些siRNA被组装进入一种RNA诱导的沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC，由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成，作用是对靶mRNA进行识别和切割）。最后，这些siRNA与靶mRNA分子互补配对，并引导RISC剪切、降解RNA分子。因此说siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA。其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达，所以是一种典型的负调控机制。小干扰RNA（smallinterferingRNA;siRNA）和微小RNA的异同点miRNA与siRNA的作用机制：miRNA与siRNA的区别：miRNA产生：细胞内RNA的固有组分之一（正常）来源：内源转录本直接来源：发夹状pre-miRNA结构：单链互补性：不完全互补，存在错配现象对靶RNA特异性：相对较低，一个突变不影响miRNA的的效应途径：miRNA途径对RNA的影响：在RNA代谢的各个层面进行调控功能：调节内源基因的表达在蛋白质合成水平发挥作用，与mRNA的稳定性无关siRNARNAi的活性形式，病毒感染和人工插入dsRNA之后诱导而产生（异常）转基因或病毒ＲＮＡ（外源）长dsRNA双链，3‘端有2个非配对碱基，通常为UU完全互补较高，一个突变即引起RNAi沉默效应的改变RNAi途径降解靶mRNA抑制转座子活性和病毒感染在转录后水平发挥作用，影响mRNA的稳定性相同点/联系点siRNAmiRNA长度及特征都约在22nt左右，5’端是磷酸基，3＇端是羟基合成的底物miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的Dicer酶依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点Argonaute家族蛋白都需要Argonaute家族蛋白参与RISC组分二者都是RISC组分，所以其功能界限变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠作用方式都可以阻遏靶标基因的翻译，也可以导致mRNA降解，即在转录水平后和翻译水平起作用进化关系可能的两种推论：siRNA是miRNA的补充，miRNA在进化过程中替代了siRNAmiRNA与siRNA的联系不同点/分歧点siRNAmiRNA机制性质往往是外源引起的，如病毒感染和人工插入dsRNA之后诱导而产生，属于异常情况是生物体自身的一套正常的调控机制直接来源长链dsRNA发夹状pre-miRNA分子结构siRNA是双链RNA，3‘端有2个非配对碱基，通常为UUmiRNA是单链RNA对靶RNA特异性较高，一个突变容易引起RNAi沉默效应的改变相对较低，一个突变不影响miRNA的效应作用方式RNAi途径miRNA途径miRNA与siRNA的区别生物合成，成熟过程由dsDNA在Dicer酶切割下产生;发生在细胞质中pri-miRN