第七章线粒体DNA多态性

第七章线粒体DNA多态性学习目的1了解mtDNA的结构与功能、线粒体基因组;2掌握mtDNA多态性、mtDNA单核苷酸多态性、mtDNA的串联重复序列多态性、mtDNA单倍群;3了解mtDNA分型命名、mtDNA分析技术（法医mtDNA分型、人类线粒体全基因组DNA分析）;4掌握mtDNA分型的特殊问题。生物的遗传DNA的分布主要在染色体上细胞质内细胞核遗传细胞质遗传（所以说，染色体是DNA的主要载体）97.5%2.5%前言线粒体电镜照片线粒体——“能量工厂”光镜下线粒体外型多样，一般为颗粒状，电镜下的主要特征是双层膜且有嵴。线粒体中分布着三羧酸循环系统和电子传递系统，是细胞氧化磷酸化反应产生ATP的场所。此外，线粒体是核外唯一含有遗传效应物质的细胞器。线粒体是真核细胞内的重要细胞器，它是细胞的能量工厂，细胞产生能量的95%来自线粒体中进行的氧化磷酸化。除了红细胞外，人类所有体细胞都含有线粒体，其中多数细胞含有数以万计的线粒体。通常把所有细胞器和细胞质颗粒中的遗传物质，统称为细胞质基因组。把细胞质基因所决定的遗传现象和遗传规律称为细胞质遗传。◆细胞器和细胞质颗粒中的遗传物质，统称为细胞质基因组(plasmon)。由于缺乏组蛋白的保护，线粒体亦缺乏DNA损伤修复系统，mtDNA的突变率较高。一、mtDNA的结构特征线粒体是细胞质中独立的细胞器，也是动物细胞核外唯一的含有DNA的细胞器。1981年，剑桥大学的Anderson小组测定了人mtDNA的完整DNA序列，称为“剑桥序列”。第一节mtDNA的结构和功能人mtDNA是一个长为16,569bp的双链闭合环状分子，外环含G较多，称重链(H链)，内环含C较多，称轻链(L链)。mtDNA双链闭合环状在降解检材中不易被核酸外切酶影响，在法医检材中能保持mtDNA完整性。线粒体DNA惟一的细胞核外DNA，携带有编码蛋白质和RNA的基因•结构：双链16569bp，其中一条为重连，一条为轻连。基因编码物各不相同。基因中不含非编码序列，多数情况下，几乎不含终止密码。转录与翻译均在线粒体中进行。DNA不与组蛋白结合部分密码子不同于核基因组密码子。特征（1）碱基结构紧凑、简洁：以最少碱基数编码尽量多的蛋白质和RNA♦基因间无间隔序列♦基因内无内含子、前导序列、带帽序列和终止信号♦相邻基因甚至有碱基的重叠（2）不存在同源基因间的重组与交换结果：mtDNA所有序列变异呈单倍型特性精细胞卵细胞遗传密码与一般的通用密码不同密码子核DNAmtDNAUGA终止色氨酸AGA,AGG精氨酸终止AAA赖氨酸天冬酰胺AUA异亮氨酸蛋氨酸甲硫酰胺AUGAUA起始甲硫酰胺AUGAUGAUAAUUAUC功能：储存信息---编码参与氧化磷酸化蛋白质和RNA的基因H链：2个rRNA，14个tRNA，12个蛋白质L链：8个rRNA，1个蛋白质自身复制---单向复制:置换环复制或D-环(D-loop)复制特点：不对称的复制，H链和L链各有一个复制起点，先复制H链，H链复制到达L链起始点后，L链开始复制D-环：新合成第三条H链姊妹链，序列与L链互补H链复制起点附近（520-700），高变异转录功能--两条链同时转录合成RNA--对称转录mtDNA与核常染色体DNA的比较mtDNA核常染色体DNA结构闭合、环状子，无组蛋白线状，形成核小体大小大小为16,569bp约30亿bp数目50～几千个拷贝/细胞1个拷贝/细胞编码约有1,100bp非编码区基因组大部分为非编码区遗传方式母系遗传孟德尔方式遗传重组不发生重组，单倍型遗传发生重组突变率高低全序列获得1981年,Aderson序列（剑桥序列）2001年草图二、mtDNA的遗传学特征1.mtDNA为母系遗传2mtDNA高拷贝和异质性3mtDNA复制分离和瓶颈效应4.mtDNA的阈值效应5半自主的细胞器二mtDNA•母系遗传线粒体基因组的遗传表现出典型的母系遗传的特点：只有女性患者可将致病基因传递给后代，而后代无论男女均可发病。精子的线粒体外膜上存在有泛素，当精子进入卵子后，受精卵以一种主动的方式降解了来自精子的线粒体及其中的DNA。高拷贝和异质性mtDNA在一个细胞中具有数百次拷贝，因此mtDNA突变比例可以在0到100%之间变化，异质性：一两个不同的mtDNA序列存在于一个个体的细胞、组织和不同的个体时。•阈值效应（thresholdeffects）对于异质性的mtDNA突变，细胞可以承受正常的mtDNA减少直到一个阈值时细胞才调亡或细胞的功能受损。mtDNA突变所产生的效应取决于该细胞中野生型和突变型线粒体DNA的比例，只有突变型DNA达到一定数量（阈值）才足以引起细胞的功能障碍，这种现象称为阈值效应。阈值效应的一个表现就是在某些线粒体遗传病的家系中，有些个体起初并没有临床症状，但随年龄增加由于自发突变、环境选择等原因，突变型DNA逐渐积累，线粒体的能量代谢功能持续性下降，最终出现临床症状。mtDNA突变可以影响线粒体功能，引起ATP合成障碍，导致疾病发生，但实际上基因型和表现型的关系并非如此简单。突变型mtDNA的表达受细胞中线粒体的异质性水平以及组织器官维持正常功能所需的最低能量影响，可产生不同的外显率和表现度。瓶颈效应：卵细胞中有100000左右拷贝的mtDNA，在受精卵形成时，只有数个拷贝卵细胞的mtDNA进入到受精卵，这个现象称为瓶颈效应。因此异质性的母亲的孩子通常会有平均水平不同的异质性突变。可以解释在一些线粒体遗传病具有很高的家族间临床变异性。mtDNA的复制分离mtDNA自主复制，不依赖核染色体而将复制后的DNA分配到子细胞中去（这个过程称为复制分离）。在一个个体中，突变mtDNA的比例随着复制分离而发生改变，随着时间积累导致表现型的改变。半自主性的细胞器线粒体基因组能够单独进行复制、转录及合成蛋白质，但这并不意味着线粒体基因组的遗传完全不受核基因的控制。线粒体自身结构和生命活动都需要核基因的参与并受其控制，说明真核细胞内尽管存在两个遗传系统，一个在细胞核内，一个在细胞质内，各自合成一些蛋白质和基因产物，造成了细胞核和细胞质对遗传的相互作用。线粒体遗传系统仍需依赖于细胞核遗传系统细胞分裂时，突变型和野生型mtDNA发生分离，随机地分配到子细胞中，使子细胞拥有不同比例的突变型mtDNA分子。•在连续的分裂过程中，异质性细胞中突变型mtDNA和野生型mtDNA的比例会发生漂变，向同质性的方向发展。表型的高度多态（polymorphism）mtDNA突变所产生的表型极为多态。在一个家系中，患病个体的表现可以完全不同；有的以血管病变为主，如中风、冠心病等；有的表现为不同程度的肌无力；有的以精神症状为主；有的以眼科疾病为突出表现。发病的年龄差异也很大。突变率比较高主要分布控制区（D-环区）-含有启动子和重链复制的起点跨距约1100bp，个体间存在较大差异高变区HV-I29～408号碱基HV-II15996～16401号碱基HV-III438～574号碱基主要原因A:mtDNA没有组蛋白的保护B:DNA聚合酶缺乏3’-5’外切酶校正功能C:缺乏DNA损伤的修复体系D:mtDNA极少或不受来自选择压力的影响突变类型碱基的错配---序列多态性主要为转换（90%）：嘧啶转换HV-I80%HV-II20%少数是顛换（10%）：C→A或A→C插入或缺失----长度多态性poly—C：nt16184-nt16193(HV-I)CA重复：nt514-nt523(HV-III)mtDNA多态性的类型•1.点的多态性表现为DNA链中发生单个碱基的突变，且突变导致一个原有酶切位点的丢失或形成一个新的酶切位点。Southern杂交即可诊断。•2.序列多态性①由于DNA顺序上发生突变如缺失、重复、插入所致。②由于高变区（highlyvariableregion）内串联重复顺序的拷贝数不同所产生的，其突出特征是限制性内切酶识别位点本身的碱基没有发生改变，改变的只是它在基因组中的相对位置。mtDNA多态性的应用：1.线粒体DNA与遗传性疾病的研究。2.生物进化学者分析人类线粒体DNA与其他物种的对比，旨在确定它们的亲缘关系。3.在法医学上用于个体识别。mtDNA单核苷酸多态性概念：一个种族不同个体的基因组或共同序列之间，存在单个核苷酸的差异，这种差异就叫mtDNASNP在人群中，SNP总有最小的等位基因频率，在单核苷酸多态性一般有两个等位基因，最小等位基因频率实际就是较小的等位基因频率。在不同的民族、地区中，同一个等位基因的频率有高有低。线粒体DNA序列中有1122个碱基是非编码序列，在编码区55个碱基不参与编码蛋白。1981年Anderson等人完成最初的剑桥序列，样本主要是欧洲血统的个体（这些样本包括一部分HeLa细胞和牛的序列参入在内）。再次分析序列更正了最初序列，确定了11处错误。现在以修正序列为准。实际线粒体序列共有16569bp。为了保持历史数据，由一个缺失占据一个位置。•序列多态性（Sequencepolymorphism）主要集中在D-loop区（法医学价值所在）HV1：nt16024～nt16365，342bp；HV2：nt73～nt340，268bpHV3：nt438～nt574，137bp•长度多态性（Lengthpolymorphism）nt514-nt523：CA重复C-stretch:polyC在法医学上常用的位点Controlregion(D-loop)1/16,569cytbND5ND6ND4ND4LND3COIIIATP6ATP8COII12SrRNA16SrRNAND1ND2COIOH9-bpdeletionOLFVL1IQMWANCYS1DKGRHS2L2EPTHV1HV216024163657334016024576“16,569”bp122tRNAs2rRNAs13genesHeavy(H)strandLight(L)strandCodingRegionmtDNA-STR主要集中在D-loop区；核心序列一般在10bp以下，常见的是CA重复（nt514-nt523）和polyC（nt568-nt573和nt303-nt309）.CA重复：重复次数在10次以下。•近期研究表示线粒体DNA中某些重复序列与疾病有关。如线粒体DNA拷贝数大大低于正常，可引起致死性婴儿呼吸障碍。实际人类mtDNA的长度不总是16569bp,可能会有10bp左右的增加。mtDNA多态性分析技术•长度多态性：AMP-FLP分析技术•序列多态性PCR-RFLP法PCR-SSO杂交法PCR—DNA自动测序目前分析mtDNA多态性最常用，也是最准确的方法。mtDNA单倍型在分子进化的研究中，线粒体单倍型或单倍群是一组类似的单倍型，它们有一个共同的单核苷酸多态性祖先。单倍群由相似的单倍型组成，所以可以从单倍型来预测单倍群。而单核苷酸多态性分析被用来确认单倍型。单倍群以字母来标记，并且以数字和一些字母来补充。与Y染色体DNA单倍群区别。遗传漂变：源自世代遗传过程中随机抽样引发的随机波动。单倍型的比例来源：基因突变和遗传漂变。人类线粒体DNA单倍型类群人类线粒体DNA单倍型类群是遗传学上依据线粒体DNA差异而定义出来的单倍群。可以追溯母系遗传的人类遗传。人类线粒体DNA单倍型以字母来标记，根据种群的不同把线粒体DNA单倍型分类mtDNA分型命名线粒体DNA序列分析完成后，编辑和审查序列未知样本Q与已知的对照序列K（或修订剑桥序列）比对，记录SNP位点位置，等位基因种类、最后确定分型。已知序列常用D-环区的HVR-Ⅰ、HVR-Ⅱ和AC重复序列。命名1:插入1个碱基，命名为插入位置.1插入碱基测序方法分析mtDNA序列多态性过程1.样本mtDNA提取2.PCR扩增HV1和HV2区域3.正、反向引物对HV1和HV2区域进行序列4.对比正反向序列确定mtDNA序列5.与Anderson序列对比找出不同碱基6.确定该样本mtDNA的单体型样本mtDNA提取样本：主要是缺乏毛囊的毛干，暴