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西洋参皂苷Rb1的提取及抗氧化活性的研究衣洁菡目录前言111目的和意义2国内外的研究现状3人参皂苷的分类4实验方法及步骤5人参皂苷Rb1的抗氧化性能67本项实验的创新点前言西洋参是人参的一种，又称花旗参，两者虽然同种，但因为气候影响，前者的参面横纹比后者更明显，有效成分含量也较高。人参皂苷为西洋参的主要有效成分，它具有西洋参根的主要生理活性，是由皂苷元和糖相连构成的糖苷类化合物。人参皂苷•人参皂苷属三萜类皂苷。依人参皂苷的非糖基苷元结构的不同，可分为三类：一类为齐墩果烷型五环三萜皂苷，另两类均为达玛烷型的四环三萜类皂苷。四环三萜类皂苷分为原人参二醇类皂苷（PPD）和原人参三醇类皂苷（PPT）。ginsenosideR1R3R3PPDTypeRb1-Glc-Glc-Glc-Glc-HRb2-Glc-Glc-Glc-Ara(pyr)-HRc-Glc-Glc-Glc-Ara(fur)-HRd-Glc-Glc-Glc-HF2-Glc-Glc-H(R,S)-Rg3-Glc-Glc-H-H(R,S)-Rh2-Glc-H-HcompoundK-H-Glc-HPPTTypeRe-H-Glc-Rha-GlcRf-H-Glc-Glc-GlcRg1-H-Glc-Glc(R,S)-Rg2-H-Glc-Rha-H(R,S)-Rh1-H-Glc-HClassificationofGinsenosidesMajorginsenosidesRb1,Rb2,Rc,Rd,ReandRg1ModificationMinorginsenosidesRg3,Rh1,Rh2,compoundK1237891011121314151617HO1819R230R1O4529286R3O2021222324262725Rb1的药理活性•人参皂苷Rb1对心脏收缩有抑制作用。•人参皂苷Rb1和人参皂苷Re均可减少缺血再灌注心肌细胞的凋亡。•人参皂苷Rb1对缺血性脑损伤有保护作用，但并不呈现剂量依赖性。•人参皂苷Rb1具有促进周围神经轴突生长的作用，具有促进血清蛋白质合成的作用，同时还有抑制中性脂肪分解、促进胆固醇再合成以及促进DNA合成、荷尔蒙分泌等作用。12确立分离纯化西洋参皂苷Rb1的可行路线,完善制备工艺，实现人参皂苷Rb1的大批量制备。研究Rb1的抗氧化活性，为人参相关功能性食品的开发提供理论依据。目的和意义Rb1的国内外的研究现状人参总皂苷的提取方法的研究进展：水浸提法醇提法水-醇提取法醇-吸附树脂法人参单体皂苷Rb1的分离提纯方法的研究进展：硅胶柱层析法薄层层析法离心薄层层析法有机溶剂沉淀法高效液相色谱法超声提取法乙酰化衍生物分离法大孔吸附树脂比色法液滴逆流色谱法泡沫分离法模拟移动床色谱法实验方法及步骤：一、总皂苷的提取：1、取西洋参60ºC烘干粉碎，称取100g，用12倍量的70%的乙醇水浴加热回流提取3次（400mL×3），每次2小时。2、三次提取液混合，减压浓缩至50mL，得西洋参粗提液。3、D101大孔吸附树脂的预处理（具体见相关参考文献）4、西洋参粗提液用15倍量的水溶解，过滤后上预处理好的D101大孔吸咐树脂柱。先用水洗柱以除去大部分杂质，再用2%的NaOH溶液洗柱除去色素，后用2%的HCl溶液洗柱，再用水洗柱至流出液为中性。最后用90%（浓度根据文献及具体情况）的乙醇淋洗，收集流出液。5、流出液回收，60ºC减压干燥，得干燥黄白色粉末为西洋参总皂苷，称重并用HPLC检测人参皂苷Rb1和Re的质量分数。二、人参皂苷Rb1和Re的分离:取西洋参总皂苷6.0g，用30mL70%的乙醇溶解，加入300mL丙酮搅拌（丙酮的加入必须在搅拌下缓缓进行，以免二醇组皂苷析出过快将大量的三醇组皂苷包裹在沉淀中，而达不到预期的分离效果），析出沉淀，静止放置。过滤沉淀并干燥，得棕黄色干燥粉末为A部分（Rb1），称重。将母液回收，减压蒸干，得棕黄色粉末为B部分（Re），称重。HPLC分别测定A、B中Rb1和Re的质量分数。三、人参皂苷Rb1和Re的纯化：A部分用20mL水溶解，加200mL丙酮搅拌，析出大量沉淀，静置，过滤，沉淀再用20mL水溶解，加200mL丙酮同法处理，静置，过滤，60ºC减压干燥，得黄白色干燥疏松粉末，为人参皂苷Rb1。称重并用HPLC检测，人参皂苷Rb1的质量分数。A部分丙酮沉淀的母液回收溶剂至干，得到的粉末与B部分合并，用30mL95％的乙醇溶解，加300mL丙酮搅拌，析出沉淀，静置，过滤，母液回收至干，再用20mL95％乙醇溶解，加200mL丙酮同法处理，过滤，溶液回收至干，再用丙酮同法处理一次，过滤，回收溶液至于，60℃减压干燥，得黄白色干燥疏松粉末，为人参皂苷Re。称重并用HPLC检测人参皂苷Re的质量分数。1、Rb1的纯化：2、Re的纯化：四、人参皂苷Rb1的抗氧化性能2.清除超氧阴离子能力的测定：采用邻苯三酚-鲁米诺化学发光体系，向样品池中依次加入不同浓度待测样品溶液50μL(空白试样为对照样)，加入6.24×10-4mol/L的邻苯三酚50μL于发光仪的反应池内,原位注入900μL鲁米诺(5mmol/L)-碳酸盐缓冲液(pH10.2)，迅速启动发光,测定20s内发光强度。本底不加邻苯三酚。1.清除羟自由基能力的测定：利用CuSO4-Luminol-Vc-H2O2体系产生·OH，向样品池依次加入50uL的待测样品，1mmol/L的硫酸铜50uL，1mmol/L的Vc20uL,，1mmol/L的鲁米诺50uL，pH9.24的硼砂缓冲液780uL，1mmol/L的过氧化氢50uL，整个反应体系为1mL，迅速启动发光，记录100s内发光强度。本底不加双氧水。3.对DNA损伤的保护作用：采用CuSO4-Phen-Vc-H2O2-DNA化学发光体系，用0.1mol/L醋酸缓冲溶液(pH5.5)配制CuSO4-Phen-DNA混合溶液，使CuSO4、Phen、DNA终浓度分别为7.5×10−5mol/L、5.25×10−4mol/L、3.0ug/mL。向发光池中加入样品溶液（空白缓冲液为对照样）100μL，4.2×10−3MVc100μL，CuSO4-Phen-DNA混合溶液0.8mL，200μL3%H2O2立即启动发光系统，间隔2s记数，记录300s内的发光强度。本底不加双氧水。四、人参皂苷Rb1的抗氧化性能4.血红细胞影泡膜的制备：取健康加抗凝剂的猪血，离心法分离，去除上层血浆和白细胞层。将沉淀用0.9%生理盐水离心清洗三次，必将洗净的血红细胞与生理盐水配成1：1的红细胞悬浮液。将配好的红细胞悬浮液与pH7.8的PBS(10mM)缓冲溶液1：15混合，低渗溶血一小时或冷藏过夜处理。用15000r/min，4℃左右离心40min。倾去上清液，加配制的PBS缓冲液离心清洗三次，直至最后得到接近乳白色的物质就为学红细胞影泡膜。小心吸取出来后，用PBS配成1：30的膜液（A）冷藏。5.对羟自由基诱导的细胞膜损伤的保护作用：CuSO4-Phen-血细胞膜溶液的配制：分别称取邻菲啰啉（Phen）0.0527g，硫酸铜0.0368g于同一烧杯溶解，用pH7.8的PBS定容至50mL，溶液，稀释10倍后与膜(A)液5：1配成体系膜液。向发光池中加入待测样品100μL，CuSO4-Phen-血细胞膜（CuSO4-Phen2.46×10−4M；4.43×10−4M）混合溶液760μL，2.1×10-2mol/lVc40μL，12%H2O2100μL，立即启动发光系统，间隔6s记数，记录300s内的发光强度。本底不加双氧水。本项试验的创新之处：firstthenAfterthat本文通过溶剂选择扩大各单体人参皂苷溶解度差异，通过简单的沉淀手段实现人参皂苷的大批量分离制备。本实验采用萃取、大孔树脂进行分离纯化，得到总皂苷和单体皂苷；采用高效液相对单体成分进行定量测定，结果稳定、可靠。完善制备工艺，实现人参皂苷Rb1的大批量制备。研究Rb1的抗氧化活性，为人参相关功能性食品的开发提供理论依据。论文工作计划与进度安排•2012年9月-10月：完成总皂苷的提取，并用HPLC检测人参皂苷Rb1和Re的质量分数。•2012年10月-11月：完成人参皂苷Rb1和Re的分离，HPLC分别测定A、B中Rb1和Re的质量分数。•2012年11月-12月：完成人参皂苷Rb1和Re的纯化，并用HPLC检测，人参皂苷Rb1和Re的质量分数。•2012年12月-2013年1月：完成人参皂苷Rb1的抗氧化性能的测定。•2013年1月-3月：完成毕业论文。