Gateway反应体系

文中如未特别指出，PCR程序均为：95℃预变性5',95℃变性30,60℃退火30,72℃延伸1'30(短片段30),30个循环后延伸10min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。1.1.1载体构建及鉴定1．PCR产物的纯化参见安比奥生物科技公司的PuprepPCRPurificationKit说明书。2.载体构建（Gateway技术）pDONR201是一种attP供体载体，用于BP反应构建入门载体，包含抗kan和抗cm筛选标记，并且含有ccdB基因，ccdB基因编码干扰大肠杆菌DNA促旋酶的一种蛋白，从而抑制标准大肠杆菌宿主的生长。当目的载体和入门克隆发生重组时，ccdB基因被目的基因取代。携带有ccdB基因的未反应载体或保留有ccdB基因副产品的细胞将不会生长。GatewayN-GFP一种attR目的载体通过LR反应构建目的基因的表达载体（图3.3），含有35S组成型强启动子、抗氨苄青霉素基因和抗除草剂筛选标记基因Bar，还含有绿色荧光蛋白报告基因GFP。表达载体Gatewaypleela（图2.2）含有35S组成型强启动子、抗氨苄青霉素基因和抗除草剂筛选标记基因Bar，通过LR反应构建目的基因的表达载体。图2.2pDONR201的结构BP反应体系(attBxattP→attLxattR)attB-PCR产物40-100fmol,25-50ngpDONR™75ng5xBPClonase™-buffer1μlTEBuffer(pH8.0)orH2Oto4.5μlBPClonase™0.5μlTotal5μl反应体系放于25°C下温育2h。反应后，加2μl2μg/μl的ProteinaseK在37°C下处理10min，再将BP产物（入门载体）加2μl转入大肠杆菌DH5α，在含kan的LB板上筛选，克隆并保存入门载体。LR反应体系(attLxattR→attBxattP)入门载体25-50ng目的载体75ng5xLRClonase™-buffer1μlTEBuffer(pH8.0)orH2Oto4.5μlLRClonase™0.5μlTotal5μl体系放于25°C下温育2h，反应后，加2μl2μg/μl的ProteinaseK在37°C下处理10min，再将2μl反应产物（表达载体）转入大肠杆菌DH5α在含AmpLB板上筛选，克隆并保存入门载体。3.质粒提取（安比奥试剂盒说明书）（1）将含有目的质粒的细菌接种到2-5ml的LB培养基中，37度培养12-16h,取菌液1.5-6ml于干净的1.5mlEP管中10000rpm1min。（2）将细菌重悬于buffer250ulPB1中（已加RNAase）,窝旋振荡，务必使细菌充分分散。（3）加入250ulbufferPB2,轻轻颠倒离心管4-6次。使溶液充分混允。使溶液澄清，一般反映不要超过5min。（4）加入350ulbufferNB3,轻轻颠倒离心管4-6次。使溶液充分混允，静置3-5min.（5）14000rpm离心10min,将上清转移到含收集管的离心柱内。（6）1000-12000rpm离心1min，倒去收集管内的液体，并将离心管重新放回离心柱内。（7）加入0.5ml的bufferPB4于离心柱内，1000-12000rpm离心1min，倒去收集管内的液体，并将离心管重新放回离心柱内。（8）加入750ul的bufferWB于离心柱内,1000-12000rpm离心1min，倒去收集管内的液体，并将离心管重新放回离心柱内。（9）重复8一次。（10）高速离心（13000-14000rpm）2min,将离心柱盖子打开在室温下风干5-10min后置于一干净的1.5ml的离心管中。（11）加入50ulbufferEB或者是PCR水于离心柱的滤膜中央，静置1-3min,10000rpm，1min则溶液里含有目的质粒。（12）将质粒置于-20度保存。注意：bufferPB1在用之前必须要加RNAase，且要放在2-8度保存；bufferWB用前必须要加24ul无水乙醇。4.大肠杆菌感受态细胞的制备（1）取出保存于-80℃的菌种，用接种针挑取大肠杆菌在LB琼脂平板上划线，37℃培养12-16h。（2）挑取一个单菌落接种于20mlLB液体培养基中，37℃培养过夜。（3）按照1:100的比例取500µl菌液接种于含50mlLB液体培养基的200m1三角瓶中，37℃培养。（4）其间不断观察菌的状态，待菌生长至对数期中期(OD600=0.4-0.6)，约需3hr(可在菌液下垫上一本书，待书中字迹刚模糊时，即可)，将菌液转入50ml无菌离心管中。（5）在冰上放置5min，4℃5000rpm/5min收集菌体，弃尽培养液。（6）用预冷的去离子水洗涤沉淀，4℃5000rpm/5min收集菌体。（7）沉淀加入2ml预冷的0.05mol/LCaC12-15%甘油混合溶液，轻轻吹散，冰预5min，4℃5000rpm/5min收集菌体。（8）沉淀加入2ml预冷的0.05mol/LCaCl2-15%甘油，混合溶液，轻轻吹散，即为感受态细胞悬液，以120µl为一份分装于Eppendorf管中，液氮速冻，存于-80℃，可保存半年。5.质粒对大肠杆菌的转化（1）加入适量连接产物或质粒于120µl大肠杆菌感受态细胞中混匀，在冰上放置20min,使连接产物充分附着在大肠杆菌感受态细胞的壁上。（2）42℃热击50s，立即置于冰上2min。（3）加入800µlLB液体培养基，置于37℃培养箱中，或于37℃摇床中培养1.5-3h。（4）6000rpm/2min收集菌体,吸弃720µl上清，重悬菌体于剩余的200µlLB液体培养基中,将菌液涂布于含相应抗生素的LB琼脂平板上。（5）倒置平板，37℃培养过夜(12－16h)。6.农杆菌感受态的制备――电击法运用电击法转化农杆菌，可以大大提高农杆菌的转化率，每微克DNA可以得到109～1010转化体，这些参数包括电场强度，电脉冲长度和DNA浓度，电压更高或电脉冲更长时，转化效率将会有所提高，但由于细胞生存率降低，转化效率的提高将被抵消。制备用于电穿孔的细胞要比制备感受态细胞更容易的多，细菌生长到对数中期后加以冷却，离心，然后用低盐缓冲液充分清洗以降低细胞悬液的离子强度，用10%甘油重悬细胞，使其浓度为3×1010细胞/ml，在于冰上速冻后置于-80℃储存，这样，每小份细胞融解后即可用于转化，其有效期至少为6个月，电转化在低温下0~4℃进行，将DNA和冷却的细胞悬液混合，然后转移到一个预冷电击槽内，通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。1.1.2植物转化农杆菌介导的拟南芥转化――浸花法(1)待转化植物材料准备温室土培的拟南芥植株，待其抽苔15厘米高时剪去苔的顶端花序，使腋生花序生长。待植株的待开花蕾数量较多时剪去已经开放的（约在去掉顶端后5-6d)，即可作用转基因材料。(2)农杆菌准备接种阳性农杆菌GV3101于20mlYEB培养基(含适当抗生素)，28℃200rpm过夜，然后接种至200ml扩大培养，至OD600为1.2左右，离心收集菌体后重悬于200ml渗入缓冲液(5%蔗糖，0.02%表面活性剂SilwetL-77)。(3)浸花法转化将装满200ml溶有菌体的渗入缓冲液置于小烧杯中，将植有拟南芥的小花盆倒置于小烧杯上，轻轻搅拌溶液，大约5min后将植株移出溶液，侧置于托盘中，闭光2d，然后直立培养，浇透水。在温室中继续培养，收获种子。