07(11)第十一章-层析技术-全

第十一章层析技术生物分离过程的一般流程原料液细胞分离(离心，过滤)细胞－胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液－胞外产物粗分离(盐析、萃取、超过滤等)纯化(层析、电泳)脱盐(凝胶过滤、超过滤)浓缩(超过滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性原料液细胞分离(离心，过滤)细胞－胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液－胞外产物粗分离(盐析、萃取、超过滤等)纯化(层析、电泳)脱盐(凝胶过滤、超过滤)浓缩(超过滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性层析技术◆层析技术原理层析分离是利用混合液中各组分的物理化学性质（分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以不同比例分布在两相中。◆其中一个相是固定的称为固定相(固体或吸附在固体上的液体），另一个相是流动的，称为流动相（液体或气体）。◆当流动相流经固定相时，各组分以不同的速度移动，从而使不同的组分分离纯化。层析技术（chromatography）一、层析技术一般原理二、层析技术分类及应用一、层析技术原理层析技术是一种物理的分离方法。无论何种层析，其系统通常由互不相溶的两个相组成：一是固定相（固体或吸附在固体上的液体），一是流动相（液体或气体）。层析时，利用混合物中各组分理化性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、溶解度等）的差异，使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度移动而最终被分离。样品在层析时的移动速度可用迁移率Rf值表示：样品原点到斑点中心的距离Rf=——————————————样品原点到溶剂前沿的距离基本概念（1）分配系数溶质在固定相与流动相浓度比值（2）解离常数有效结合位子浓度与溶质在液相的浓度乘积与溶质在固相中的浓度比值（3）分离因素某一瞬间被吸附溶质量占总量的分数(4)阻滞因子分配层析溶质移动速度（距离）与流动相移动速度（距离）比值(5)洗脱（容积）溶出体积在柱色层分离中，使溶质从柱中流出时所通过的流动相体积(6)分辨率两峰之间的距离与两峰宽的平均值之比(7)理论塔板流动相与固定相平均浓度达传质平衡时的一段柱高（8）溶量因子固定相中溶质总量与流动相中溶质总量之比色层分离法基本原理色层分离法基本原理分子筛层析示意图t1t0t1t2t0t0t3t1t2t0分子量：分配系数在一定的温度下，溶质在两液相之间的平衡关系服从分配定律：Kd=C1/C2Kd为分配系数C1，C2为两液相中的溶质浓度。应用条件：温度一定低浓度解离常数和分离因数）mt-结合溶质分子的有效位子总浓度m-空余的有效结合位子浓度q-溶质在固相的浓度c-溶质在液相的浓度解离常数图22-3恒定缓冲液条件下，色层分离的拖尾现象的移动距离前缘在同一时间内溶剂溶质的移动距离移动速度流动相在层析系统中的溶质的移动速度)(fRsdmAKAVV积能进行分配的有效截面溶质移动距离Rf=sdmmAKAA阻滞因数Am—流动相的平均截面积As---固定相的平均截面积流动相的移动距离＝V/Am洗脱容积Ve在柱色层分离中，使溶质从柱中流出时所通过的流动相的体积保留时间（tR）和保留体积（VR）反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一理论塔板fr—第r块塔板上溶质的质量分数为：rrnrEEErnrnf)1()11()!(!!222)1/(2)1/()1/(21EnEEnEreEnEfrr＝nE/(E+1)时rmax＝nE/(E+1)最大浓度塔板rmax＝nE/(E+1)E=22-16N越大，加入的溶剂越多，展开的时间越长色带下移高峰浓度减少、色带扩大层析法分类（按装置分类）纸层析薄膜层析柱层析洗脱液样品填充物分部收集玻璃柱薄膜层析二、层析法分类及原理（按分离原理分类）1、吸附层析2、分配层析3、凝胶层析（分子筛层析）4、离子交换层析5、亲和层析6、聚焦层析层析方法分离依据吸附层析利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离分配层析利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化层析聚焦将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离各类层析的原理和载体类别分离原理基质或载体吸附层析化学、物理吸附硅胶、氧化铝、羟基磷酸分配层析两溶剂相中的溶解效应纤维素、硅藻土、硅胶凝胶层析分子筛效应的排阻效应sepharose、sephadex离子交换层析离子基团的交换反应离子交换树脂、纤维素、葡聚糖亲和层析分离物与配体之间有带配基的sepharose特殊亲和力或sephadex聚焦层析等电点和离子交换作用多缓冲交换剂（与带有多种电荷基团的配体相偶联的sepharose6B）1、吸附层析（absorptionchromatography）原理：以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流动相。由于各种物质的极性不同，被吸附剂吸附的程度和在流动相中的溶解度不同。层析时，当流动相从固定相上流过时，各组分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，从而以不同速度随流动相向前移动。载体：硅胶氧化铝羟基磷石灰应用：分离纯化蛋白质、酶、氨基酸、核苷酸等生化物质树脂的网络骨架吸附法概述活性炭（Activecarbon）氧化铝硅胶主要优点是化学惰性，具有较大的吸附量，易制备不同类型的多孔硅胶，一般以SiO2.xH2O通式表示。||OO||—Si—O—Si—OH||OO||吸附法典型的吸附过程包括四个步骤：待分离的料液通入吸附剂吸附质被吸附在吸附剂表面料液流出吸附质解吸吸附剂再生2、分配层析原理：分配层析实际上是一种连续抽提方式。如纸层析中滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机溶剂为流动相（展开剂）。当流动相沿滤纸经过样品点时，样品点中的溶质在水和有机相中溶解度不同而不均匀地分配在两相中，各种组分按其各自的分配系数进行不断分配，从而使物质得到分离和纯化。载体：纤维素硅藻土硅胶应用：各种生化物质的分离鉴定逆流分溶原理示意图物质Y(Kd=1)的分配情况溶剂A物质Z(Kd=3)的分配情况溶剂B总量总量总量总量总量总量平衡后转移1转移2转移3分溶管号转移4上相转移下相转移上相转移管中蛋白质总量物质Y物质Z分溶曲线管号有效分配系数（Keff）某一物质在A相中的总量某一物质在B相中的总量分配层析技术分配层析法（液-液层析法，LLC）原理：利用混合物在两种不相混溶的液相（固定相和流动相）之间的分配系数的不同而达到分离各组分的目的。固定相液体均匀覆盖于载体表面，流动相流过固定相。分配系数：当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在固定相和流动相两相内的浓度之比是个常数，称为分配系数。K=c1/c2分配系数小的溶质在流动相中的分配的数量多，移动快；分配系数大的溶质在固定相分配的数量多，移动慢。因此可彼此分开。特点：液-液层析法适合于分离同系物或同分异构体ABCDE3216168168441212228128层析柱分离物质的示意图：固定相为固体颗粒，装在层析柱内，高5cm，固定相周围充满液体流动相，每厘米柱中液相体积为1cm3。若在柱顶加入1cm3溶剂,其中含32mg样品，同时应有相同体积的溶剂从柱底流出，此时样品处于柱中A位置。若样品的分配系数是1，则它在固相与液相间等量分配。若再有1cm3的溶剂加到柱上，A部分中的溶剂带着16mg的物质向下移动到B，A和B中的物质都将发生再分配，不同组分的含量不同组分在柱中的位置上部中部下部不同物质分配系数不同时：3、凝胶层析（gel-filtrationchromatography）原理基质葡聚糖凝胶（sephadex）琼脂糖凝胶（sepharose）应用测定分子量脱盐和浓缩分离提纯生物大分子除去热原物质(微生物代谢产物，如内毒素)凝胶层析原理示意图凝胶层析与洗脱曲线凝胶颗粒收集蛋白质管蛋白质混合物大分子从柱上面加缓冲溶液小分子洗脱体积（Ve）凝胶柱大分子小分子Ve1Ve2V0蛋白质Mr=49,000洗出液中的蛋白质浓度洗脱体积（mL）未知logMr洗脱体积与相对分子质量的关系Andrews的经验公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)球蛋白Mr“选择性曲线”G-200G-100logMrKav4、离子交换层析（ion-changechromatography）原理基质疏水型离子交换剂；亲水型离子交换剂应用制备纯化生物物质定量、定性测定混合物中各组分1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合2.吸附阶段：样品与反离子进行交换3、4.解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用12345原始缓冲溶液的反离子样品溶液梯度浓度吸附交换分离法原理示意离子交换层析原理示意图蛋白质浓度洗脱体积带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质收集样品的管收集样品的管带负电荷的蛋白质蛋白质混合物玻璃柱带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质收集样品的管NaClNaCl梯度离子交换树脂的结构其结构由三部分组成：1.不溶性的三维空间网状结构构成的树脂骨架，使树脂具有化学稳定性和机械强度；2.是与骨架相联的功能基团；3.是与功能基团带相反电荷的可移动的离子，称为活性离子，它在树脂骨架中的进进出出，就发生离子交换现象。离子交换树脂的结构-网络骨架苯乙烯系、丙烯酸系、酚醛系、环氧系离子交换树脂结构骨架：接有功能基团，本身是惰性功能基团：连接在骨架上，可与相反离子结合待交换分子：在吸附阶段可与活性离子交换，与骨架上的功能基团结合活性离子：与功能基团所带电荷相反的可移动的离子离子交换树脂结构的简单表示：R－SO3－H＋(Na＋)阳离子交换树脂高分子基质;固定离子基团；反离子（活性离子）R－SO3－骨架；SO3－H＋(Na+)化学功能团。活性离子为阳离子，称阳离子交换树脂，与阳离子发生交换活性离子为阴离子，称阴离子交换树脂，与阴离子发生交换离子交换法是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而达到分离纯化的方法。离子交换层析原理主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离。选择适当条件可使一些溶质分子变成离子态，通过静电作用结合到离子交换剂上，而另一些物质不能被交换，这两种物质就可被分离。带同种电荷的不同离子虽都可以结合到同一介质上，但由于带电量不同，与介质的结合牢度不同，改变洗脱条件可依次被洗脱而达到分离的目的。离子交换层析原理++++++++++++++++++++++++++++++++Startingbuffercounter-ionsSubstancestobeseparatedGradientions离子交换层析原理开始吸附解吸解吸结束再生①②④⑤③样品解吸剂再生剂-----++-------离子交换树脂的分类按化学功能团分1.阳树脂，酸性基团，(弱酸性、强酸性)2.阴树脂，碱性基团，(弱碱性、强碱性)活性离子H＋氢型阳树脂；活性离子OH－羟型阴树脂；活性离子为其它离子统称盐型树脂。1阳离子交换树脂交换前交换达到平衡后2阴离子交换树脂交换前交换达到平衡后常用的阳离子交换剂离子交换剂可电离基团可电离基团结构CM-纤维素（弱酸型）羧甲基P-纤维素（中强弱酸型）磷酸基SE-纤维素（强弱酸型）磺乙基SP-纤维素（强弱酸型）磺丙基常用的阴离子交换剂AE-纤维素（弱碱型）氨基乙基离子交换剂可电离基团可电离基团结构PAB-纤维素（弱碱型）对氨基苯甲酸DEAE-纤维素二乙基氨基乙基DEAE-Sephadex二乙基氨基乙基DEAE-纤维素（强碱型）二乙基氨基乙基QAE-纤维素（强碱型）二乙基（2-羟丙基）-氨基乙基（中弱碱型）（中弱碱型）离