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山东大学实验报告2011年3月27日姓名张行润系年级2009级生科4班学号200900140177同组者于潜科目生物化学实验题目醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白仪器编号105一、实验目的掌握醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白的原理和方法。二、实验原理蛋白质是两性电解质。在pH值小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH值大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在同一pH的溶液中，所带净电荷不同，故可利用电泳法将它们分离。血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸祖坟、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。由表可知，血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH值7.0，所以在pH8.6的缓冲液中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极移动。蛋白质名称等电点相对分子质量白蛋白4.8869000α1-球蛋白5.06200000α2-球蛋白5.06300000β-球蛋白5.1290000~150000γ-球蛋白6.85~7.50156000~300000在一定范围内，蛋白质的含量与结合的燃染料量成正比，故可将蛋白质区带剪下，分别用0.4mol/LNaOH溶液浸洗下来，进行比色，测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，测定其相对含量。肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、慢性炎症、妊娠等都可以使白蛋白下降。肾病时α1、α2、β球蛋白升高，γ-球蛋白降低。肝硬化时α2、β-球蛋白降低，而α1、γ-球蛋白升高。三、实验器材1、醋酸纤维薄膜（2cm*8cm，厚度120μm）2、人血清；3、烧杯及培养皿数只；4、点样器；5、竹镊子；6、玻璃棒；7、电吹风；8、试管六只；9、恒温水浴锅；10、电泳槽；11、直流稳压电泳仪；12、剪刀四、实验试剂1.电极缓冲液2.染色液（可重复使用，使用后回收）3.漂洗液（100ml每组）：95%乙醇45ml，冰醋酸5ml，水50ml。4.透明液（20ml每组）：无水乙醇：冰醋酸=7：3。5.健康人血清（新鲜，无溶血现象）。6.巴比妥-巴比妥钠缓冲液：取两个大烧杯，分别称取巴比妥钠和巴比妥溶解于500ml蒸馏水中；五、实验步骤⒈薄膜浸泡：提前将醋酸纤维薄膜浸泡30min以上；⒉电泳仪检查：水平检查，电源检查；⒊电泳槽的准备：在两个电极槽中，各倒入等体积的电极缓冲液。将滤纸条对折，翻过来，用电极缓冲液完全浸湿，架在电泳槽的四个膜支架上，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱逐气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，故称为滤纸桥。⒋点样：取新鲜血清于载玻片上，将盖玻片掰呈适宜大小，使一边小于薄膜宽度。把浸泡好的可用的醋酸纤维素薄膜取出，用滤纸吸去表面多余的液体，然后平铺在滤纸上，将盖玻片在血清中轻轻划一下，再在膜条一端1.5~2cm处轻轻地水平落下并迅速提起，即在膜条上点上了细条状的血清样品，呈淡黄色。⒌电泳：用镊子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上(点样面朝下)、另一端平贴在阳极端支架上,用镊子将其中气泡赶出。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。盖上电泳槽盖。接好电路，调节电压到90V，预电泳10min，再调电压至110V，电泳时间50min～1h。⒍染色：将染液倒入大培养皿中，电泳完毕立即用镊子取出薄膜，直接浸入染色液中，染色9min，然后取出。⒎漂洗：配制好漂洗液，将染色完毕的薄膜自染液中取出，直接放入漂洗液中，连续更换几次漂洗液，直到薄膜背景几乎无色为止。⒏透明：配制好透明液，用镊子将薄膜取出，贴在容器壁上（烧杯壁或培养皿上等），注意不可有气泡，用吹风机稍吹干薄膜，用胶头滴管淋洗薄膜，将每组20ml透明液淋洗玩即可，再用吹风机将薄膜彻底吹干，此时薄膜透明，小心将薄膜自容器壁上取下。六、注意事项1.点样应细窄、均匀、集中。点样量不宜过多，点样位置要合适。2.两电泳槽内缓冲液面应在同一水平面，否则会因虹吸影响电泳效果。3.醋酸纤维素薄膜一定要充分浸透后才能点样。点样后电泳槽一定要密闭。电流不宜过大，以防止薄膜干燥，电泳图谱出现条痕。七、实验结果染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。从正极端起，依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。下面是通过本次实验获得的一条电泳带：八、结果分析本次实验得到的电泳带从效果来看不是太好，主要的问题有以下几个：1.有些电泳带参差不齐；2.个别电泳带的两条带之间界限不明显；分析可能导致实验失败或误差的原因有以下几点：1.将薄膜表面吸干时吸的太干或吸的不完全。因为点样时应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干，太干则样品不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐，影响分离效果。吸水量以不干不湿为宜；2.用镊子取薄膜并吸干、点样的过程中，薄膜可能受到了异物污染；3.缓冲液选择浓度不合适。因为缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并由于扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中不易分辨；4.电流强度控制的不好，因为电流强度高，尤其在温度较高的环境中，可引起蛋白质变性或由于热效应引起缓冲液中水分蒸发，使缓冲液浓度增加，造成膜片干涸。电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散；5.染色时间控制不合适。因为时间长，薄膜底色深不易脱去；时间短，着色浅不宜区分，或造成条带染色不均；6.透明时间控制不合适，如在透明液中浸泡时间太长则薄膜溶解，太短则透明度不佳。