第四章-生产菌种的扩大培养

第四章生产菌种的扩大培养目前工业规模的发酵罐容积已达到几十立方米或几百立方米。如按10%的种子量(接种比例)计算，就要投入几立方米或几十立方米的种子液。要从保藏在试管斜面中的微生物菌种逐级扩大为生产用种子是一个由实验室制备到车间生产的过程。其生产方法与条件随不同的生产品种和菌种种类而异。如细菌、酵母菌、放线菌或霉菌生长的快慢；产孢子能力的大小；及对营养、温度、需氧等条件的要求均有所不同。因此，种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量足够的种子。这种种子接入发酵罐后，将使发酵生产周期缩短，设备利用率提高。种子液质量的优劣对发酵生产起着关键性的作用。种子扩大培养：将保存在砂土管、冷冻(干燥)管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面，活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。种子：经过上述种子扩大培养过程得到的纯种培养物称为种子。种子扩培的目的：接种量的需要；菌种的驯化；缩短发酵时间、保证生产水平；发酵生产对种子的要求：1.细胞的生长活力强，接种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；2.生理性状稳定；3.菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；4.无杂菌污染；5.保持稳定的生产能力。第一节种子的制备过程种子制备的过程大致可分为：实验室种子制备阶段和生产车间种子制备阶段实验室阶段：所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂中这些培养过程一般都在菌种室完成。生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，在工程上一般归为发酵车间管理。一、实验室种子的制备实验室种子制备有两种方式：固体培养法，适用于产孢子能力强、孢子发芽、生长繁殖快的菌种，孢子可直接作为种子罐的种子。操作简便，不易污染杂菌。液体培养法，适用于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种。(一)孢子的固体制备法1.霉菌孢子的制备霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基；培养的温度一般为25～28˚C；培养时间一般为4～14天。2.放线菌孢子的制备放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。培养温度一般为28˚C。培养时间为5～14天。(二)液体种子制备1.好氧培养对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可采用摇瓶液体培养法。将孢子经摇瓶培养成菌丝后再进人种子罐，这就是摇瓶种子。如产链霉素的灰色链霉菌（S.griseus）和产卡那霉素的卡那链霉菌（S.Kanamuceticus）。目的就是让孢子发芽长成健壮的菌丝。2.静置培养法将接有菌种的试管斜面或克氏瓶转接到三角瓶液体培养基中静置培养，在转接到种子罐的培养过程中也无需通风。例如：生产啤酒的酵母菌一般保存在麦芽汁琼脂或MYPG培养基的斜面上，于4℃冰箱内保藏。每年移种3-4次。从三角瓶到卡氏培养罐培养期间，均需定时摇动或通气，使酵母菌液与空气接触，以有利与酵母菌的增殖。二、生产车间种子制备生产车间种子制备即实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养的过程。好氧发酵过程的种子,需供给足够的无菌空气，和搅拌，使菌体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。1种子罐级数的确定种子罐的作用：在种子罐中，微生物细胞增殖或孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。种子罐级数：制备种子需逐级扩大培养的次数。决定于2个因素：1所采用发酵罐的容积；2.菌种生长特性和孢子发芽及菌体繁殖速度；如：细菌、酵母菌：生长快，种子用量比例少，种子级数较少。茄子瓶→一级种子罐→发酵罐（二级发酵）霉菌：生长较慢，种子用量比例较大。孢子悬浮液→一级种子罐→二级种子罐→发酵罐（三级发酵）放线菌：生长更慢，种子用量比例较大。孢子悬浮液→一级种子罐→二级种子罐→三级种子罐→发酵罐（四级发酵）2确定种子罐级数需注意的问题种子级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响。种子级数越大，工艺就越难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级。种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会。但种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率。3生产车间种子制备的培养基生产车间种子制备的目的是获得一定数量和质量的菌体，培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的萌发和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。在原料方面不如实验室阶段那么精细，而是接近于发酵培养基，这有两个方面的原因：经济成本和菌种驯化。种子扩大培养实例：一、谷氨酸发酵的菌种扩大培养制备过程：斜面菌种→摇瓶培养→一级种子培养→发酵1、斜面(AS1.299)培养基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化钠0.5%，琼脂2%，pH7.0～7.2。培养条件：32℃，生长18～24小时。培养基特点：有利于菌体的生长而不产酸，以多含有机氮而不含或少含糖为原则。生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过3次；要求斜面菌种绝对纯种，不得混有任何杂菌和噬菌体。2、摇瓶种子培养摇瓶种子培养的目的在于繁殖活力强的菌体，培养基组成应以少含糖分，多含有机氮为主，培养条件从有利于长菌考虑。培养基：葡萄糖2.5％，尿素0.5％，硫酸镁0.04％，磷酸氢二钾0.1％，玉米浆2.5～3.5％，硫酸亚铁、硫酸锰各2ppm，pH7.0.培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本接近于发酵培养基。培养条件：用1L三角瓶装入培养基200mI，灭菌后置于冲程7.6cm、频率96次／min的往复式摇床上振荡培养12h，培养温度33～34℃。摇瓶种子质量要求：�种龄：12h�残糖：0.5％以下无菌检查：(-)�噬菌体检查：(-)�光密度：净增OD值0.5以上�镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐�革兰氏阳性反应3、一级种子培养(种子罐)为了获得发酵所需要的足够数量的菌体，在摇瓶种子培养的基础上进而扩大到种子罐培养。种子罐容积大小取决于发酵罐大小和接种量比例。培养基：和摇瓶种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%。培养基特点：有利于菌体的生长，更接近于发酵培养基。培养条件：接种量：0.8～1.0％，培养温度：32～34℃，培养时间：7～8h，通风量：50L种子罐1:0.5，搅拌转速340r／min；250L种子罐1:0.3，搅拌转速300r／min；500L种子罐1:0.25，搅拌转速230r／min。一级种子的质量要求：•种龄7～8h•pH7.2左右•OD值净增0.5左右(108-109个/ml)•无菌检查(-)•噬菌体检查(-)•大小均匀，呈单个或八字排列二、青霉素生产的种子制备制备过程：保种管→斜面孢子→大米孢子→一级种子→二级种子→发酵1、斜面孢子培养基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等。培养条件：25℃、7天,湿度50%左右。培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细。2、大米孢子培养基：大米及氮源（玉米浆）。培养条件：25℃、7天，控制湿度。培养基的特点：成本低；米粒之间结构疏松，提高比表面积和氧的传递，有利于孢子的产生。大米孢子的要求：1粒米含106个孢子。3、一级种子罐目的：孢子萌发，形成菌丝，菌丝浓度为6-8%。培养基：葡萄糖、乳糖、蔗糖、玉米浆、CaCO3。培养条件：空气流量1：3（体积比）；搅拌300－350r/min；27℃，40h；4、二级种子罐目的：菌丝大量繁殖，形成10-12%菌丝浓度；培养基：葡萄糖、玉米浆；培养条件：空气流量1：1-1.5（体积比）；搅拌150－200r/min；27℃、10-14h。二级种子的质量要求：菌丝呈长丝状、菌丝团很少，有中小空泡，处于Ⅲ—Ⅳ期；第二节种子质量的控制一、影响孢子质量的因素及控制1.培养基的影响1原材料质量生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。例如在四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同。制备霉菌用的大（小）米，其产地、颗粒大小、均匀程度不同，孢子质量也不同。蛋白胨：动植物蛋白及其下脚料均可作为蛋白胨的原料，例如以肝渣为原料，以鱼粉为原料，以动物胶渣为原料，以猪血为原料，以猪骨为原料都可制得。原材料质量的波动，起次要作用的是其中无机离子含量不同，如微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。2水质的影响对于发酵工厂来说，稳定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物代谢影响很大。3固体培养基中氮源种类的影响菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。控制措施：a.孢子培养基所用原料要经过发酵试验，合格后才可使用；b.孢子培养阶段，规模一般比较小，为保证孢子的质量，培养基的原料可以相对精细。c.培养基要用比较单一的氮源，作为选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源，2.培养条件除了培养基的主要影响外，培养条件也是影响孢子质量的一个主要因素。孢子的培养条件一般就两个：温度和湿度。1温度：一般各生产单位都严格控制孢子斜面的培养温度。a.温度影响微生物生理生化反应速率；b.温度影响微生物的生长发育和代谢活动；c.温度对多数菌种的孢子质量有显著的影响温度影响微生物的生长发育和代谢活动。因为一切代谢活动都依赖于酶。而酶的活力只有在最适才能发挥。在生物学范围内温度每升高10℃，生长速度通常就加快一倍；温度每升高10℃酶反应速度增加2～3倍；②湿度：培养基的湿度对孢子的数量和质量有较大的影响。如土霉素生产菌种龟裂链霉菌，孢子制备时发现：在北方气候干燥地区孢子斜面长得较快，在含有少量水分的试管斜面培养基下部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干疤状，孢子稀少。在气温高含湿度大的地区，斜面孢子长得慢，主要由于试管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。3.培养时间衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子会导致生产能力的下降。措施：孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。二、影响种子质量的因素及其控制种子质量主要受孢子质量、培养基、培养条件、种龄和接种量等因素的影响。1.培养基的影响生产阶段的种子培养过程的目的是获得一定数量和质量的菌体，因此要求：�营养成分适合种子培养的需要。�选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基；�营养成分要较发酵培养基丰富，易于被菌体直接吸收和利用；�氮源和维生素含量较高，可使菌丝粗壮并具有较强的活力；�营养成分要尽可能与发酵培养基相近。2．培养条件a.温度温度影响微生物各种酶催化反应速率；影响微生物的生长发育和代谢活动。b.pHpH影响酶的活性，pH影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的分泌，因此影响新陈代谢的进行。pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用。c.通气量在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外，有足够的通气量可以提高种子质量。例如，青霉素的生产菌种在制备过程中将通气充足和不足两种情况下得到的种子分别接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍。但也有例外，例如土霉素生产菌，一级种子罐的通气量小对发酵有利。3.种龄定义：种子罐中培养的菌体在移入下一级种子罐或发酵罐之前的培养时间。种龄一般取在细胞生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时间。过于年轻的种子会出现前期生长缓慢发酵周期延长、产物开始形成的时间推迟，甚至会因菌丝量过少而在发酵罐内结球，造成异常发酵。老化的种子会出现菌体自溶、生产能力下降的现象。4.接种量接种量也是发酵过程条件优化中的一个因素，有时对特定的产品，接种量具有重要的影响。定义：指接入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。接种量的大小决定于菌种在种子罐(发酵罐)中生长繁殖的速度。较大的接种量可缩短罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前，并可减少杂菌的生长机会。这是因为（1）种子多，种子液中含有大量的胞外水解酶，有利于对基质的利用；（2）生产菌迅