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实验一显微镜的使用及微生物大小测定的方法二、基本原理现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，它们由机械装置和光学系统两大部分组成。物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。其中油镜的放大倍数最大，对微生物学最为重要。微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具—测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。其中镜台测微尺并不直接用来测量细胞大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。目镜测微尺每小格所代表的实际长度因显微镜的不同放大倍数而异，因此用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度，然后根据微生物细胞相当于目镜测微格数，即可计算出细胞的实际大小.两重合线间镜台测微尺格数×10目镜测微尺每格长度=两重合线间目镜测微尺格数思考题1、用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油？起什么作用？答（1）应先用摖镜纸将镜头摖干净，以防止实验的污染。使用油镜时，应先用低倍镜再用高倍镜，然后再是油镜，用完之后也要用摖镜纸将油镜摖掉。（2）滴加香柏油（3）作用是增加折射率，即增加了显微镜的分辨率，油的折射率和分辨率成反比，同时与波长成正比。2、影响显微镜分辨率的因素有哪些？答：显微镜的分辨率指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力，最小分辨距离越小，分辨率越高，最小可分辨率距离=λ／2NA且NA=n.sin,所以，分辨率由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定，当然还有介质的折射率。3、为什么要换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？答：不同放大倍数，目镜测微尺每小隔所代表实际长度不一样，必须用镜台测微尺进行重新校正，这样目镜测微尺测量的长度才是目前状态的准备长度。4、在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一微生物的大小时，其测定的结果是否相同？为什么？答：相同的，不同的放大倍数，目镜测微尺每小格所代表实际长度不一样，必须重新校正，才能得到目前状态的准确长度。实验二显微镜直接计数法二、基本原理显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（又称计菌器），其优点是直观、快速、操作简单。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器及Hawksley计菌器等。利用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。此法是将单细胞微生物的悬液或孢子悬液，注入血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中。在显微镜下进行计数的，由于加盖盖玻片之后的血球计数板的计数室的容积是一定的（0.1mm3，万分之一毫升），所以可根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算单位体积内的微生物总数目，包括死菌和活菌。六、思考题根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？答：①操作时没有先盖盖玻片再加悬液导致体积不准确。避免：先盖盖玻片再滴加悬液②细胞：多稀释溶液③溶液不均匀避免：滴加溶液前混匀悬液实验三二、基本原理微生物学实验所用的器皿，大多要进行消毒、灭菌和用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包装方法均有一定的要求。玻璃器皿的形状和包装方法要求能防止污染杂菌为准；玻璃器皿的洗涤方法根据实验目的、器皿的种类、所盛的物品、洗涤剂的类别和沾污程度等的不同而有所不同。清洗后的玻璃器皿、经包装后即可进行干热灭菌。干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种（P59）。火焰烧灼灭菌适用于载玻片、试管口、玻棒、接种工具和金属用具如镊子等的灭菌。通常所说的干热灭菌是在电烘箱内利用高温干燥空气使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。而细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固变越快，反之反之。与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160－170℃），时间长（1-2h）.但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。培养基、橡胶制品、塑料制品、衣物等不能用干热灭菌。思考题1、为什么在吸管的包装时要在其粗端吸管口塞上一小段棉花？答：以免使用时将杀菌吹入其中或不甚将微生物吸出管外。2、在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？答：①物品不要摆的太拥挤，以免妨碍空气流通，灭菌物品不要直接触电热干燥箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。②干热灭菌的过程中，严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。电热干燥箱具有可以观察的窗口，灭菌的过程中玻璃温度较高，注意避免烫伤。③电热干燥箱内温度内的温度未降到70℃以前，切勿自行打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。3、为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度高，时间长？答：细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，环境和细胞水的含量越大，则蛋白质凝固就越快，反之，含水量越少，凝固就越慢。所以干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度更高，时间更长。实验四、二、基本原理牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。其配方为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，水1000ml，pH7.4~7.6。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量的琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下96℃时溶化，一般实际应用时在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。任何一种培养基，一经制成就应及时彻底灭菌，以备培养微生物使用，一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌法。高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能逸出，灭菌锅内的压力增加，使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。注意点细节：（4）升压、保压和降压：关闭排所阀后，锅内压力开始上升。当压力升到所需压力（一般培养基和器皿灭菌控制在121℃20分钟）时，控制热源，维持压力到所需时间后，停止加热，待压力降至接近”0”时，打开排气阀排气。注意不能过急地排气，否则会由于锅内压力突然下降而造成锅内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，和使棉塞沾染培养基而发生污染。（5）无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24~48小时，经检查无菌生长，可保存备用。思考题1、培养微生物的培养基应具备哪些条件？为什么？答：碳源：提供微生物营养碳素（碳架）氮源：提供微生物生长、繁殖所需氮元素无机盐：大量元素：细胞内的成分、渗透压成分、稳定PH、酶的激活剂Mg2+；微量元素：酶的激活剂，特殊分子或结构生长因子：一种微生物正常代谢必不可少，且不能由简单碳源、氮源合成的有机物，一般需要量很少，在微生物体能的功能主要是辅酶或辅基水：在生命过程中必不可少2、在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？答：1、当然是注意浓度配比不要搞错2、很多培养基的加料顺序有讲究，否则会有沉淀产生3、有些培养基会有不溶物质，分装前应摇匀4、不要忘了调节pH值（一般细菌都需要，酵母可能自然pH就行，不过不一定）5、加热溶解时尽量不要煮沸，会损失营养物质3、培养基配制完后，为什么要及时灭菌？若不能及时灭菌，应如何处理？答：培养基里含有丰富的氮源，碳源，微量元素等等。如果不立即灭菌，那么，就会长菌。你可能会认为再灭菌不就可以了？！但是，很多的微生物，特别是真核微生物在生长的时候会改变溶液的PH，同时灭菌后细胞破碎，带入新的氨基酸，蛋白等，这些都是试验不稳定的因素。如果不能立刻灭菌，应该在配置培养基的时候直接称取粉末，不加入水溶解，可在室温保存。如果加入的是液体的，已经配置好的培养基，应该在4度并保存，但时间不宜过长。4、高压蒸汽灭菌中为什么要把冷空气排净，为什么在灭菌后不能骤然快速降压？答：在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全是极为重要的，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。如果骤然快速降压，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。实验五二、基本原理将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。无论微生物的分离、培养、纯化或鉴定经及有关微生物的形态观察及生理研究都必须进行接种。接种的关键是要严格的进行无菌操作，如操作不慎引起污染，则实验结果就不可靠。影响下一步工作的进行。微生物的培养特征是指微生物在固体、半固体和液体培养基中生长后所表现出的群体生长特征。不同的微生物有其固有的培养特征，这些特征可以作为不同种类微生物的鉴别特征之一，并能为识别纯培养是否被污染作为参考。了解它们的培养特征、掌握其生长规律对识别、控制和利用微生物具有重要价值。固体培养基又分平板和斜面两种形式。在平板上主要观察菌落表面结构、形态及边缘状况（如P75图C）斜面上主要观察菌苔的形态。思考题：1、用斜面检测微生物的培养特征接种时，为什么不要划多条线或蛇形，而只要划一条直线？答：用斜面接种微生物是为了能挑去微生物培养的单菌落，若划多条线或蛇形容易形成菌苔，失去斜面的培养意义。2、接种环(针)接种前后灼烧的目的是什么？为什么在接种前一定要将其冷却？如何判断烧过的接种环已冷却？答：①为了消毒灭菌芽孢等，消灭可能引起污染的一切生物体；②若没有冷却的话，接种的微生物也会被灼烧致死，所以一定要冷却；③一般用接种环在玻璃器皿的上盖内侧接触一会（大约5s），然后用接种环接触培养基，培养基没有被烫坏，没有冷热物接触而发出滋滋声，就认为已冷却，可以接种了。3、试述如何在操作中贯彻无菌操作的原则？答：在超净工作台中无菌操作或在酒精灯附近操作，且接种前后接种环都需要过火并灼烧成红色。试管口（接种管）开关试管帽前后也需过火，若为平板培养则倒平板过程前后培养基的开口处都要在火焰中过一下。接种完毕后，接种环仍需要过火消毒。在个人操作时尽量挽起衣袖，双手用70%酒精消毒，并戴上手套操作。实验六二、基本原理革兰氏染色将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的，革兰氏阳性细菌细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫——碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性不同，由于细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高。所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫——碘的复合物比较容易被洗脱，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结果的正确性，采用规范的染色方法是十分重要的。2、初染滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1～2min，水洗。3、媒染用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。4、脱色用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌，脱色时间一般约20～30s。5、复染用番红液复染约2min，水洗6、镜检干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的是革兰氏阴性菌。思考题：1、你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？①涂片过程中涂片不宜过厚；②初染；③媒染；④脱色；⑤复染。最关键的环节是乙醇脱色。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度，阳