核酸的提取、纯化和电泳检测实验报告

分子生物学实验山东大学生命科学学院核酸的提取、纯化和电泳检测摘要质粒是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法等等，其中碱变性法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的，本实验采用碱变性法提取E.coliDH5α中Puc19质粒DNA，并通过RNase消化及酚-氯仿抽提除去质粒DNA溶液中的RNA以及RNase等一些可溶性蛋白，最后获得纯度较高的质粒DNA。细菌基因组DNA呈环状裸露于拟核区，本实验中细菌染色体DNA的提取采用试剂盒的方式。本实验的目的在于掌握碱变性法提取质粒DNA及染色体DNA提取的原理、各种试剂的作用和方法，掌握DNA的纯化方法，即用RNase消化RNA以及用酚、氯仿抽提法除去质粒中的蛋白质，学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化及纯度检测的实验原理，凝胶的制备及电泳方法及相应的方法操作。关键词质粒DNA碱变性提取法琼脂糖凝胶电泳细菌染色体DNA引言1.核酸分离纯化1.1总原则保证核酸一级结构的完整性化学损伤——缩短化学试剂作用时间，以减少其对核酸的损失；物理损伤——动作轻柔以减少机械剪切力；尽量低温操作以减少高温损伤；生物降解——加入相应酶抑制剂，防止生物降解排除其他分子的污染蛋白质——苯酚/氯仿/蛋白酶KRNA污染——RNase其他DNA——区别变性与复性有机溶剂——萃取、乙醇沉淀与洗涤金属离子——乙醇沉淀与洗涤1.2核酸纯化应达到的要求核酸样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子其他生物大分子的污染应降到最低程度排除其他核酸分子的污染1.3核酸提取的一般过程破碎细胞（防止核酸酶的作用）破碎抽提核酸(裂解细胞释放内容物)——关键步骤核酸的纯化除去杂质（蛋白质、脂类、核酸）4°C最佳和最简单；-70°C是长期保存的良好温度，为一次性保存；-20°C核酸样品的保存（主要条件时温度和介质）-TE缓冲液最常用分子生物学实验山东大学生命科学学院2.质粒DNA的提取及纯化——碱变性提取法（碱裂解/变性法）RNase消化及酚-氯仿抽提2.1质粒DNA的制备方法质粒(Plasmid)是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。细菌质粒大小介于1～200Kb之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA。提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验选择碱裂解法提取质粒DNA。提取原则：①尽量保持核酸的完整性，即保持天然状态，防止核酸酶对核酸的降解（生物损伤），也要防止化学因素（酸、碱等）或物理因素（高温、机械剪切等）引起核酸变性或破坏。②最大限度减少染色体DNA的污染，去除RNA、可溶性蛋白质杂质。2.2碱裂解法碱裂解/碱变性法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，是基于染色体DNA（线性DNA）与质粒DNA（超螺旋DNA）的变性与复性的条件差异而达到分离目的。质粒DNA具特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA变性，去除变性条件又可以使DNA复性。碱裂解法根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。SDS处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒DNA及细菌基因组DNA从细胞中同时释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.8的KAc(或NaAc)高盐缓冲液调节其pH值至中性时，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，变性的质粒DNA恢复原来的共价闭合环状超螺旋构型，而溶解于溶液中；而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，染色体DNA不能复性而与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的网状结构呈白色絮状沉淀，这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNaseA将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA，之后可再用超离心、电泳、离子交换柱层析等方法进一步纯化质粒。分子生物学实验山东大学生命科学学院总结：碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。3.细菌染色体DNA的提取3.1细菌基因组DNA特点细菌的染色体基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成细菌的染色体相对聚集在一起，形成一个较为致密的区域，称为类核（nucleoid）。类核无核膜与胞浆分开，类核的中央部分由RNA和支架蛋白组成，外围是双链闭环的DNA超螺旋。染色体DNA通常与细胞膜相连，连接点的数量随细菌生长状况和不同的生活周期而异。在DNA链上与DNA复制、转录有关的信号区域与细胞膜优先结合，如大肠杆菌染色体DNA的复制起点（OriC）、复制终点（TerC）等。细胞膜在这里的作用可能是对染色体起固定作用，另外，在细胞分裂时将复制后的染色体均匀地分配到两个子代细菌中去。有关类核结构的详细情况目前尚不清楚。具有操纵子结构（有关操纵子结构详见基因表达的调控一章）其中的结构基因为多顺反子，即数个功能相关的结构基因串联在一起，受同一个调节区的调节。数个操纵子还可以由一个共同的调节基因（regulatorygene）即调节子（regulon）所调控。在大多数情况下，结构基因在细菌染色体基因组中都是单拷贝但是编码rRNA的基因rrn往往是多拷贝的,这样可能有利于核糖体的快速组装，便于在急需蛋白质合成时细胞可以在短时间内有大量核糖体生成。3.2细菌染色体DNA提取的原理基因工程实验所需要的基因组DNA通常要求分子量尽可能大，以此增加外源基因获得率，但要获得大片段的DNA非易事。细菌基因组是环状DNA，在抽提过程中，不可避免的机械剪切力必将切断DNA。因此要尽可能地温和操作，减少剪切力，减少切断DNA分子的可能性；分子热运动也会减少所抽提到的DNA分子量，所以提取过程也要尽可能在低温下进行。另外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的DNA，所以制备过程要抑制其核酸酶的活性。在提取过程中EDTA的作用就是螯合二价金属离子，起到抑制核酸酶活性的作用。与质粒DNA相比选择琼脂糖凝胶浓度应低。4.琼脂糖凝胶电泳进行DNA的分离纯化4.1电泳电泳(electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。坚韧细胞壁、细胞膜染色体DNARNA、可溶性蛋白质溶菌酶、SDS变性复性条件不同蛋白酶、RNase、有机溶剂分子生物学实验山东大学生命科学学院凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭(ethidiumbromide，EB)或SYBRGold染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。分子生物学中，常用的两种凝胶为琼脂糖(agarose)和聚丙烯酰胺凝胶。这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶分辨率高，使用于较小分子核酸(5—500bp)的分离和蛋白质电泳。它的分辨率非常高，长度上相差1bp或质量上相差0.1%的DNA都可以彼此分离，这也是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行DNA序列分析的分子基础。虽然它能很快地进行电泳，并能容纳较大的DNA上样量，但是与琼脂糖凝胶相比，在制备和操作上繁琐。琼脂糖是从海藻中提取的长链状多聚物，由β-D-吡喃半乳糖与3,6-脱水-L-吡喃半乳糖组成，相对分子质量为104-105。琼脂糖加热至90℃左右，即可溶化形成清亮、透明的液体，浇在模版上冷却后形成凝胶，其凝固点为40-45℃。琼脂糖凝胶相对于聚丙烯酰胺凝胶分辨率低，但它的分离范围更大(50至百万bp)，小片段DNA(50-20000bp)最适合在恒定轻度和方向的电场中水平方向的琼脂糖凝胶内电泳分离。琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA的相对分子质量，分离经限制酶水解的DNA片段，进一步纯化DNA等。4.2琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳，以琼脂糖凝胶为支持物，利用DNA泳动时的电荷效应和分子筛效应，使不同大小的DNA分子根据分子量而分离，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭(EB)或SYBRGold染色直接观察到，甚至含量少至20Pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。4.21琼脂糖每一个琼脂糖链含有大约800个分子，琼脂糖聚合链形成螺旋状纤维聚集成直径20-30nm的超螺旋结构。纤维是半刚性的，琼脂糖浓度不同，形成的纤维长度不同。固化的时候，螺旋纤维形成三维的筛网，琼脂糖浓度不同，形成的通道直径50nm到200nm，三维结构依赖于氢键维持，加热成液体状态就破坏了氢键。【琼脂糖的凝胶性是由存在的氢键所致，凡是能破坏氢键的因素都能导致凝胶性的破坏。】4.22电泳迁移速率的影响因素糖凝胶电泳是一种常用的方法，溶液中，核酸在溶液中由于磷酸基而带负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面六个因素：①样品DNA分子的大小：电泳时，线性双螺旋DNA分子是以头尾位向前迁移的，其迁移速度与分子量（所含碱基）的对数值成反比，这是因为大分子有更大的摩擦阻力。②DNA分子的构象：分子量相同而构象不同的DNA分子，其迁移速率不同。在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA(covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA）的一条链断裂，变成开环DNA(opencircleDNA,ocDNA）分子，如果两条链发生断裂，就转变为线状DNA(LinerDNA）分子。这三种构型的分