TAILPCR技术简介

TAILPCR技术简介2012-09-22中南民族大学生命科学学院吴俊杰•一.TAILPCR技术原理•二.TAILPCR实验操作流程•三.TAILPCR注意事项•四.TAILPCR应用•一.原理：热不对称性PCR(thermalasymmetricinterlacedPCR,简称TAIL-PCR)，是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物(specialprime,简称sp1,sp2,sp3),用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物(Arbitrarydegenerateprime简称AD)相组合,以基因组DNA作为模板,通过3轮具热不对称的温度循环的分级反应来进行PCR扩增，从而获得已知序列旁的侧翼序列。已知序列(T-DNA)未知序列SP1SP2SP3AD第一轮产物第二轮产物第三轮产物第一轮模板为基因组DNA，引物SP1+AD第二轮将第一轮产物稀释1-1000倍作为模板，SP2+AD第三轮将第二轮产物稀释1-1000倍作为模板，SP3+AD•二.TAIL-PCR的操作流程：•1.基因组DNA的获取：可用CTAB/SDS提取真菌或植物基因组DNA，用溶菌酶法提取细菌基因组DNA。以基因组DNA作为第一轮PCR反应的模板。：•2.已知序列的验证：•在进行PCR实验之前必须对已知序列进行验证，以确认已知序列的正确性。具体方法为：根据已知序设计特异性引物（扩增长度最好不少于500bp），对模板进行PCR扩增，然后对PCR产物进行测序，再与参考序列比较确认已知序列的正确性。•3.引物的设计：TAIL-PCR反应对引物的要求较高，3个嵌套的特异性引物长度一般在20~30bp之间，Tm值一般设58~68℃。SP1、SP2和SP3之间最好相距100bp以上以便在电泳时更容易区分3轮PCR产物.随机引物是按照物种普遍存在的蛋白质的保守氨基酸序列设计的，相对较短，长度一般是14bp左右，Tm值介于30~48℃之间。•4.三次TAILPCR反应：•第1次PCR反应由5次高特异性反应、1次低特异性反应、10次较低特异性反应和12次热不对称的超级循环构成。通过5次高特异性的反应,使sp1与已知的序列(载体或T-DNA等)退火并延伸,异引物SPl与已知的序列退火并延伸，目标序列扩增成直线性型上升，1次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上,接下来10次较低特异性的反应使两种引物均能与模板退火,从而使原来由高严谨性循环所产生的单链靶DNA复制成双链DNA.最后是进行12次热不对称的TAIL循环(超级循环即高特异性和低特异性循环交替)，目的片段得以指数性地扩增。三轮TAILPCR反应程序•。经过第一轮的PCR反应得到了不同浓度的3种类型产物：类型1是特异引物和随机引物之间扩增的产物（即目标产物；类型2是单独由特异引物扩增的产物；类型3是单独由任意引物引发的产物。增加目标产物浓度特异性增加目标产物浓度特异性增加目标产物浓度在第三阶段结束后，基本上只有类型1产物，即目的产物。•5.取第一，第二，第三轮PCR产物各3ul,用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测.6.切胶回收清晰的电泳条带，以SP3为引物对PCR产物进行测序验证.TAILPCR实验操作流程•三.TAILPCR注意事项：•1.引物设计：特异引物长度为22-26nt,GC含量为45%-55%，Tm一般为58～68℃。再按照物种普遍存在的蛋白质的保守氨基酸序列设计一系列简并引物,简并引物相对较短,长度为14bp,Tm为30～48℃。特异引物与随机引物Tm值要求至少相差10度以上。特异性引物和简并引物的选择直接影响扩增的效果。如果不能获得满意的扩增结果,则应该在预备实验中重新设计特异性引物或者换用其它的简并引物。•2.TAILPCR的引物浓度：为减少错配，特异引物应保持较低浓度；而简并引物的浓度要高，一般为2.5～5.0pmol/μL，以满足引物的结合效率。•3.反应条件：•在TAIL-PCR反应中，高特异性循环的退火温度设为65℃左右，较低特异性循环的退火温度设为44℃，低特异性循环的退火温度设为25～3O℃。在高严紧的循环中，退火温度要尽可能高，比特异引物的Tm要高1-5度。•可根据需要选择延伸时间，延伸时间长可以获取较长的DNA片段，但是容易产生非特异性PCR扩增。推荐延伸时间为2min。•四.TAILPCR应用：该技术具有简单快速、特异性高、分离出的DNA序列可以用于图位克隆、遗传图谱绘制和直接测序.TAILPCR技术能够分离获得克隆载体上的DNA序列,也能够用于基因组小的物种(如拟南芥，水稻)和基因组大的物种（如小麦以及哺乳动物）的已知序列两侧翼的DNA序列的分离.•谢谢•