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第四章微生物的实验室培养一、实验原理大肠杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。微生物接种的方法有很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落。二、实验目的1、掌握用平板划线法分离纯化大肠杆菌的方法；2、掌握用稀释涂布平板法分离纯化大肠杆菌的方法。三、仪器与用具高压灭菌锅，超净工作台，接种环，培养皿，酒精灯，试管，玻璃涂布器，pH试纸，微量可调移液器，恒温培养箱，大肠杆菌，微生物的实验室培养试剂盒。四、实验准备称取微生物培养试剂盒中的固体培养基6.4g加入200mL水中，加热充分溶解（可按培养的微生物最适合生长条件需要调节pH），121℃高压灭菌20min待用，可倒平板10个。称取2g液体培养基加100mL蒸馏水溶解，调节pH至7.0，121℃高压灭菌20min，冷却后在超净台接入100μL大肠杆菌菌种，恒温振荡器37℃震荡培养12小时，用灭菌离心管每组分装1mL实验备用。五、实验步骤1、倒平板操作：⑴将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手打开封口膜。⑵右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。⑶用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约20mL）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。⑷等待平板冷却凝固，大约需要5～10min。然后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。2、平板划线操作：⑴将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红；⑵在火焰旁冷却接种环，并打开试管帽；⑶将试管口通过火焰；⑷将已冷却的接种环深入菌液中，沾取大肠杆菌液。⑸将试管口通过火焰，并盖上试管冒。⑹左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速深入平板内，划三到五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。⑺灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区全自动高压灭菌锅超净工作台带有防紫外灯伤害装置，安全可靠。垂直流形，准闭合式玻璃门，可有效防止外部气流透入，及操作异味对人体的刺激。采用可调风量风机系统，电器开关控制。保证工作区风速始终处于理想状态。域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。3、系列稀释操作：⑴将分别盛有9mL水的5支试管灭菌，并按101～105的顺序编号。⑵用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第二支试管中。吹吸三次或震荡，使菌液与水充分混匀。⑶从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复第2步的操作。依次类推，直到完成最后一只试管的稀释。4、涂布平板操作：⑴用火焰灼烧涂布器灭菌，然后冷却8～10s。⑵取少量菌液（100μL），滴加到培养基表面。⑶用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。六、实验结果与分析如图3所示，大肠杆菌经通过稀释涂布和划线的方法得到分离，最终得到大肠杆菌的单菌落。图3大肠杆菌稀释涂布和平板划线分离