石蜡组织切片

石蜡组织切片技术步骤：杀死与取材、固定、洗涤、脱水、透明、浸蜡与包埋、切片与贴片、染色、封固等。（一）杀死与取材1、动物致死的方法（1）麻醉法：乙醚或氯仿；或4%戊巴比妥做静脉注射，剂量一般按动物体重每公斤1ml；或用20%氨基酸乙酯作腹腔注射，剂量一般按动物每kg5ml。乙醚麻醉对丘脑下部神经分泌物的染色标本不利。（2）空气栓塞法：不宜用于血管标本的制作。（3）击头法：（4）断头法：（5）放血法：有利于肠系膜铺片的制作。无论何种致死法，都要求动作迅速，因为动物一旦死亡，其组织与细胞及开始自溶。2、取材注意事项：（1）速度要快，材料新鲜取材后立即投入固定液中，防止组织会收缩变形，发生自溶现象。脏器的上皮组织最易变质，应争取在半小时内处理完毕。（2）组织块力求小而薄组织块的大小一般为0.5×0.5×0.2cm、1×1×0.3cm或1.5×1.5×0.3-0.5cm，最厚不能超过0.5cm。（3）切取组织应根据需要观察的部位进行选择所取组织应包括脏器或组织的重要结构或全层，同时考虑好切面方向。病理组织除切取病变部位外，还要切取病变和正常组织交界区域，以利观察分析。（4）勿使组织块受挤压切取组织，刀要锋利，动作要轻，不可来回切割，也不要挤压或牵拉组织。夹取组织时，切勿猛压。（5）保持材料的清洁组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等，可用生理盐水冲洗。（6）尽量保持组织的原有形态柔嫩、薄的材料，有空气的组织（7）组织块附加标记的方法不同的组织块，要根据切片的要求和需要分瓶放入进行固定，加标签以示区别，并注明固定液、名称、来源、日期等等。（二）固定1、固定的目的（1）迅速阻止组织、细胞的死后变化，防止自溶与腐败，使之尽量保持生前的形态与结构。（2）使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持其原有状态。（3）使组织内各种物质成分产生不同的折光率，以便染色后易于鉴别和观察。（4）使组织块硬化，使在脱水、包埋、切片、染色等过程中不易损坏，并便于制作薄片。（5）使组织成分对染料有不同的亲和力，经过染色处理后易于辨认。（6）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。2、固定的方法（1）蒸汽固定法：比较细小而薄的标本，可用锇酸或甲醇蒸气固定。（2）注射、灌注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部或需要对整个动物进行固定。这时宜采用注射固定法，将固定液注入血管，经血管分枝到达整个组织和全身，从而得到充分的固定。局部灌注固定全身灌注固定无论那种灌注固定，在灌注完成时，必须将组织块、器官或整个动物再放入同样的固定液中进行固定。（3）小块组织固定法：取下的小块组织，立即置入液态固定剂中进行固定，这是应用最广泛最经常的方法。3、固定的注意事项及影响因素固定液的用量应充足，一般为组织块体积的10~20倍左右。瓶底垫上脱脂棉或几层滤纸更好，以便固定液能从上下左右前后渗入组织块。软组织或较大块组织可先经2～3小时固定后，再修整成小块重投入新配制的固定液内继续固定。固定时间应根据组织的种类、性质、大小，固定液的种类、性质、渗透力的强弱而定。如：一般组织，以10％福尔马林固定24h左右，波恩(Bouin)氏固定液12至24h，卡诺氏(Carnoy)固定液1h内。适当地增加温度可缩短固定时间。4、常用固定液：固定液特点：①有较强的渗透力，能迅速的渗入组织内部②不使组织过度收缩或膨胀，并能使组织内待观察的成分凝固为不溶性物质③能使组织达到一定的硬度，并获得较佳的折光率和对某种染料具有较强的亲和力。（1）单纯固定液10%福尔马林固定液：甲醛10ml蒸馏水90ml优点：透渗能力强，固定均匀，组织收缩小。缺点：但经乙醇脱水后收缩较大。酒精固定液：优点：有固定兼脱水作用，固定后可直接放入85％－95％酒精中脱水。对糖原、纤维蛋白和弹性纤维等固定效果好。缺点：但固定速度较慢，易使组织变脆。一般先用85％酒精固定数小时再放入95％酒精继续固定。苦味酸固定液：优点：1、苦味酸固定的组织并不硬化，经酒精脱水后，其硬化程度增加不大。2、苦味酸有软化皮肤和溶化肌腱粘蛋白的作用，适宜制作毛皮和肌腱切片。缺点：1、固定后，细胞收缩明显，经酒精脱水和浸蜡包埋后收缩加剧，其收缩程度可达50%左右。2、固定组织不宜超过24小时，时间过长对碱性染料染色不利。固定后应即转入70%酒精中，经一定时间洗去苦味酸.重铬酸钾：PH在4.2以下时可固定染色体，使细胞质和染色质沉淀成网状，但线粒体被破坏。PH在4.2以上时，染色体被溶解，细胞质得到良好的固定，且能固定类脂，使之不溶于脂溶剂，故能保存高尔基复合体及线粒体。升汞：能较好的显示细胞核。醋酸：对染色质和染色体的固定与染色都很好。但它既不能保存糖，又不能固定脂肪及类脂，因此，在固定线粒体及高尔基体时忌用高浓度醋酸。丙酮：广泛应用于组织化学中酶的固定。锇酸：用它固定的组织块必须小而薄，适于显示线粒体与内质网，一般只用于某种特殊染色或电镜切片染色或固定。（２）混合固定液波恩(Bouin)氏固定液：饱和苦味酸水溶液75ml甲醛25ml冰醋酸5ml渗透迅速，固定均匀，组织收缩小，切片着色良好。卡诺氏(Carnoy)固定液：无水乙醇60ml三氯甲烷（氯仿）30ml冰醋酸10ml固定速度快，可固定细胞浆和细胞核，尤其适宜染色体的固定。中性福尔马林固定液甲醛100ml蒸馏水900ml磷酸二氢钠4g磷酸氢二钠6.5g渗透性好，组织收缩小，固定效果好。此外，还有辛克(Zenker)氏液、酒精福尔马林液(A·F·)等混合固定液。（三）洗涤目的：组织在固定后要把渗入里面的固定液洗去，否则留在组织中的固定液有的会妨碍染色，有的会产生沉淀或结晶。原则：1、固定液为酒精或酒精混合液，一般不冲洗。2、固定液为甲醛水溶液或以水配制，如含铬或锇的固定液，可用流水冲洗。3、冲洗的时间与组织的种类，组织块大小和固定时间长短有关。一般10-24h。方法：流水缓慢冲洗。小组织可不冲洗，多次换水浸泡即可。（四）脱水目的：把组织中的水份置换出来。脱水剂特征：1、能与水按比例混合；2、高浓度，一般不含水分；3、也能与透明剂混合。前二特性能达到逐步除去组织块内的水份，使组织块内的水份全部被脱水剂所取代；后一特性则为下一步骤中的透明剂完全取代组织内的脱水剂创造条件。脱水剂类型：1、一般脱水剂或称单纯脱水剂，2、脱水剂兼透明剂。常用一般脱水剂：酒精酒精脱水注意事项：1、一般从70％酒精开始，由低浓度到高浓度逐步递增。如果固定液为酒精溶液，则应从与固定液中相同浓度的酒精开始脱水。2、对一些柔软组织、低等无脊椎动物组织需缩小浓度差异，应从70％酒精以下50％或30％开始脱水，否则收缩较大。3、脱水的时间根据组织的种类、体积大小和厚度而定，一般与组织的大小成正比。4、脱水必须在有盖瓶子内进行，特别是高浓度酒精。酒精脱水一般程序：70%酒精（45min-1h）→80%酒精（45min-1h）→95%酒精（45min-1h）→95%酒精（45min-1h）→无水酒精（45min-1h）→无水酒精（45min-1h）一般脱水剂还有丙酮，但对组织块的收缩较大，价格较高，故很少用于一般组织块的脱水。主要用于快速脱水或固定兼脱水，脱水时间为1－3小时左右。脱水兼透明脱水剂：脱水后直接可以浸蜡二氧陆环：对组织块收缩较少，硬化程度较低。但由于本药具有毒性价格较高，使用并不普通。正丁醇：很少引起组织块的收缩与变脆。适于制作植物标本。叔丁醇：无毒，对组织块无收缩及硬化，多用于特殊要求及精制标本。松脂醇：又名异松节油醇，对组织块收缩及硬化少，多用于经酒精及Carnoy液固定的组织，也常用于经酒精、苯处理后给切片带来困难的标本，如卵黄和角质等，特别适用于多卵黄的蛙卵及早期胚胎标本的制片。（五）透明目的：用一种既能与脱水剂相混合，又能溶解石蜡的溶剂，把脱水剂置换出来，可使石蜡浸入组织块。常用透明剂：二甲苯注意事项：1、组织不能在二甲苯透明过久，在时间上应加以控制。2、组织在入二甲苯透明前最好先放入纯酒精与二甲苯等量混合液中半小时至1小时处理。3、二甲苯透明,小块30min,大块2h,其间更换一次二甲苯。4、对着光线观察组织呈半透明或透明状态即可。组织块不能透明，呈白色混浊状态时，则为脱水不彻底，此时需再放入脱水剂中，等彻底脱水后才能透明。二甲苯透明步骤：1:1无水酒精和二甲苯（30min）→二甲苯（15min）→二甲苯（透明为止）另外还有甲苯：性质与二甲苯基本相似，在甲苯中透明12－24小时液不易变脆，可代替二甲苯。苯：用途和用法与二甲苯相似，对组织的收缩较少，是较好的透明剂。但也易挥发，易燃。吸收苯能引起中毒，故用时须小心。香柏油：优点是对组织的收缩及硬化程度比二甲苯、苯、氯仿等都要小。缺点是透明速度慢，小组织块也需12小时，不易为石蜡所代替，所以经香柏油透明的组织，必须经二甲苯或苯浸洗后才易于浸蜡。氯仿：即三氯甲烷，其透明能力差，透明时间可以长达24小时，不易使组织变脆。多用于大块组织的透明，还常用于火棉胶－石蜡双重包埋中的火棉胶块的透明。苯甲酸甲酯：对组织块的收缩及硬化甚微。由于它能溶解火棉胶，也可用于火棉胶切片。（六）浸入与包埋组织经过脱水、透明后要让石蜡、火棉胶、炭蜡、明胶等包埋剂浸入内部使它变硬，并将组织包埋进去以利于切片和观察，这个过程称为“浸入”和“包埋”。目的：把软组织变为适当硬度的蜡块，以便切成薄片包埋方法：石蜡包埋法、火棉胶包埋法、火棉胶-石蜡包埋法、明胶包埋法石蜡注意事项：1、一般常用石蜡熔点为52－60℃。夏季：56－60℃石蜡；冬季，52－54℃石蜡。2、浸蜡前可在石蜡二甲苯等量混合液内处理半小时至1小时。3、浸蜡温度（恒温箱温度）：比石蜡的熔点高2℃。4、浸蜡时间：3-5小时，期间更换一次石蜡。浸蜡步骤：1:1二甲苯和石蜡（30-45min）→石蜡（30-45min）→石蜡（30min）包埋步骤：将熔化好的石蜡倒入包埋框或包埋盒，用加温的镊子将组织块切面朝下放入，做好标记，冷却。完全凝固后，修整蜡块。包埋温度：与浸蜡的温度接近或高2℃左右。（七）切片和附贴组织经石蜡包埋后制成蜡块，用切片机切成薄片的过程称切片。1切片前的准备（1）切片前必须了解切片机的基本结构和性能。装刀架、刀片、检验刀片是否锋利及磨刀。（2）干净的载玻片、盖玻片（3）甘油蛋白（4）水浴锅、蓬松的中号毛笔，眼科镊等。2切片制作过程（1）固定刀架、刀片和蜡块。注意刀与蜡块的角度（5o）。（2）切片：切片厚度：6-8μm；转速：40至50次/min。（3）粘片：水捞法（35-45℃）或干粘法3切片常遇到的困难及矫正（1）切片不能形成蜡带：室温过低、石蜡过硬或石蜡粘度不足、蜡边过小或不平。（2）蜡带弯曲：蜡带的两侧大小不等，刀不锐利。（3）蜡片成卷：刀不锋利或不清洁，刀的倾斜过大或石蜡过硬。（4）切片出现褶皱：石蜡太软或浸蜡不够，刀钝或倾斜度过小。（5）切片薄厚不等：组织在脱水及浸蜡过程中处理不当，刀钝或切片机不佳或刀和组织块固定不牢固。（6）组织块中的结缔组织呈不透明的白色状态而破碎：脱水不彻底，透明不足而影响石蜡浸透。（7）切片呈碎卷状：脱水，透明及浸蜡时间过久或蜡温过高。（8）切片出现纵纹：刀刃有小缺口，石蜡不清洁，组织内有钙盐沉积。（9）蜡块底边成白色：刀的倾斜不足而碰撞的结果。（10）切片粘刀：刀刃不洁，刀倾斜度小，刀钝。（11）蜡块向上运行时带走切片：刀钝，刀刃背面有蜡，室温高，可用冰块冷却蜡块，也可能是蜡带的静电反应（室内过于干燥）。（八）烤片40℃需烤1天或1昼夜；60℃烤0.5至1小时，放在酒精灯上烤片（必须来回晃动），或70℃左右的温度烤片，只需3至5分钟即可。（九）染色目的：使组织或细胞不同部分呈现不同深度的颜色或完全不同的颜色，而清楚显示，便于利用光学显微镜进行观察。染料的类型碱性燃料：在溶液中能解离生成阳离子色素的染料，一般能溶于酒精和水，作为组织内酸性物质的染色，特别是胞核染色剂，如苏木精、番红、美篮等酸性燃料：是指在酸性介质中进行染色的染料，带负电荷，能溶于酒精和水，