分子生物学实验室常用仪器及使用方法

1实验指导目录实验一分子生物学实验室常用仪器及使用方法实验二质粒DNA的提取－碱裂解法实验三琼脂糖凝胶电泳实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验六动物组织细胞基因组DNA提取实验七DNA的定量实验八PCR基因扩增实验九琼脂糖凝胶电泳分离与纯化目的DNA实验十DNA重组实验十一动物组织细胞总RNA的提取实验一分子生物学实验室常用仪器及使用事实证明，在科学飞速发展的今天，无论从事哪个领域的研究，要想突破，除了有2良好的理论基础外，更重要的是依赖于先进的技术和优良的仪器设备以及良好的研究环境。一个标准的分子生物学实验室除了具有一般生物学实验室的常规仪器设备外，还具有一些特殊用途的仪器，这些仪器一般较精密，价格昂贵。下面介绍这些仪器的使用方法和注意事项。一、冷冻离心机低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中都离不开低温离心技术，因此低温冷冻离心机成为分子生物学研究中必备的重要仪器。在国内，有多个厂家生产冷冻离心机，本实验室的高速冷冻离心机为GL-20G-Ⅱ型（上海安亭），落地式。配有角式转头：6×50ml、12×10ml和12×1.5ml。极限转速20000rpm。1.安装与调试离心机应放置在水平坚固的地面上，应至少距离10cm以上且具有良好的通风环境中，周围空气应呈中性，且无导电性灰尘、易燃气体和腐蚀性气体，环境温度应在0～30℃之间，相对湿度小于80%。试转前应先打开盖门，用手盘动转轴，轻巧灵活，无异常现象方可上所用的转头。转子准确到位后打开电源开关，然后用手按住门开关，再按运转键，转动后立即停止，并观察转轴的转向，若逆时针旋转即为正确，机器可投入使用。2.操作程序（1）插上电源，待机指示灯亮；打开电源开关，调速与定时系统的数码管显示的闪烁数字为机器工作转速的出厂设定，温控系统的数码管显示此时离心腔的温度。（2）设定机器的工作参数，如工作温度，运转时间，工作转速等。（3）将预先平衡好的样品放置于转头样品架上，关闭机盖。（4）按控制面板的运转键，离心机开始运转。在预先设定的加速时间内，其运速升至预先设定的值。（5）在预先设定的运转时间内（不包括减速时间），离心机开始减速，其转速在预先设定的减速时间内降至零。（6）按控制面板上的停止键，数码管显示dedT，数秒钟后即显示闪烁的转速值，这时机器已准备好下一次工作。3.注意事项（1）离心机应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线，机器不使用，要拔掉电源插头。（2）开机前应检查转头安装是否牢固，机腔中有无异物掉入。3（3）样品应预先平衡，使用离心筒离心时离心筒与样品应同时平衡。（4）挥发性或腐蚀性液体离心时，应使用带盖的离心管，并确保液体不外漏以免腐蚀机腔或造成事故。（5）除工作温度、运转速度和运转时间外，不要随意更改机器的工作参数，以免影响机器性能。转速设定不得超过最高转速，以确保机器安全运转。（6）使用中如出现0.00或其它数字，机器不运转，应关机断电，10秒钟后重新开机，待所设转速显示后，再按运转键，机器将照常运转。（7）不得在机器运转过程中或转子未停稳的情况下打开盖门，以免发生事故。（8）每次操作完毕应做好使用情况记录，并定期对机器各项性能进行检修。二、电泳仪电泳技术是分子生物学研究不可缺少的重要手段。电泳一般分为自由界面电泳和区带电泳大类，自由界面电泳不需支持物，如等速电泳、密度梯度电泳及显微电泳等，这类电泳目前已很少使用。区带电泳需用各种类型的物质作为支持物，常用的支持物有滤纸、醋酸纤维薄膜、非凝胶性支持物、凝胶性支持物及硅胶―G薄层等，分子生物学实验中最常用的是琼脂糖凝胶电泳。应用电泳法可以对不同物质进行定性或定量分析，或将一定混合物进行组份分析或单个组份提取制备。下面以DYY-12型电脑三恒多用电泳仪（北京六一仪器厂）为例介绍其使用方法。1.使用方法（1）按电源开关，显示屏出现“欢迎使用DYY-12型电脑三恒多用电泳仪…”等字样后，同时系统初始化，蜂鸣4声，设置常设置。屏幕转成参数设置状态，见图一：U:0VU＝100V｜Mode：STDI:0mAI＝50mA｜P:0WP＝50W｜T:00:00T＝01:00｜其中:左侧大写U:I:P:T:为电泳时实际值；中间部分显示程序的常设值（预置值）。Mode(模式)：STD(标准)；TIME(定时)；VH（伏时）；STEP（分步）（2）设置工作程序。用键盘输入新的工作程序。例如，要求工作电压U＝1000V，电流4I限制在200mA以内，功率W限制在100W以内，时间T为3小时20分，并且到时间自动关掉输出。则操作步骤如下：①按“模式”键，将工作模式由标准（STD）转为定时（TIME）模式。每按一下模式键，其工作方式按下列顺序改变：STD®TIME®VH®STEP®STD。②先设置电压U，按“选择”键，先将其反显，然后输入数字键即可设置该参数的数值。按数字1000,则电压即设置完成。③设置电流I，按“选择”键，先使I反显，然后输入数字200。④设置功率P，按“选择”键，先使P反显，然后输入数字100。⑤设置时间T，按“选择”键，先使T反显，然后输入数字320。如果输入错误，可以按“清除”键，再重新输入。⑥确认各参数无误后，按“启动”键，启动电泳仪输出程序。在显示屏状态栏中显示Start!并蜂鸣4声，提醒操作者电泳仪将输出高电压，注意安全。之后逐渐将输出电压加至设置值。同时在状态栏中显示“Run”，并有两个不断闪烁的高压符号，表示端口已有电压输出。在状态栏最下方，显示实际的工作时间（精确到秒）。⑦每次启动输出时，仪器自动将此时的设置数值存入“MO”号存储单元。以后需要调用时可以按“读取”键，再按“0”键，按“确定”键，即可将上次设置的工作程序取出执行。⑧电泳结束，仪器显示：“END”，并连续蜂鸣提醒。此时按任一键可止鸣。2.注意事项(1)U、I、P三个参数的有效输入范围是：U：5～3000V；I：4～400mA；P：4～400W.(2)一般情况下，当NoLoad！时，首先应关机检查电极导线与电泳槽之间是否有接触不良的地方，可以用万用表的欧姆档逐段测量。(3)如果输出端接多个电泳槽，则仪器显示的电流数值为各槽电流之和，此时应选择稳压输出，以减小各槽的相互影响。(4)注意保持仪器的清洁，不要遮挡仪器后方进风通道。严禁将电泳槽放在仪器顶部，避免缓冲液洒进仪器内部。(5)本仪器输出电压较高，使用中应不避免接触输出回路及电泳槽内部，以免发生危险。5(6）长期不用仪器，应放置在干燥通风的清洁环境中保存。三、分析天平分析天平是定量分析工作中不可缺少的重要仪器，充分了解仪器性能及熟练掌握其使用方法，是获得可靠分析结果的保证。分析天平的种类很多，有普通分析天平、半自动/全自动电光分析天平及电子分析天平等。目前实验室常规备用的是自动化程度较高的电子分析天平。下面介绍电子分析天平PL203/01型和AL104/01型(METTLER-TOLEDO)的性能及使用方法。PL203/01型精密电子天平：最大称量210g；实际分度值0.001g；AL104/01型高分辨率电子分析天平：最大称量110g；实际分度值0.0001g1.使用方法（1）检查并调整天平至水平位置。检查电源电压是否匹配（使用配置的稳压器），按天平仪器要求通电预热至所需时间30min。（2）打开天平开关“on”，天平则自动进行灵敏度及零点调节。待显示屏上所有字段短时点亮，天平回零时，可进行正式称量。（3）称量时将洁净称量瓶或称量纸置于称盘上，关上侧门，天平将显示该重量，点击“®O/T¬”键自动校对零，然后逐渐加入待称物质，直至所需重量为止。（4）称量结束应及时除去称量瓶（纸），关上侧门，切断电源，并做好使用情况登记。2.注意事项（1）天平应放置在牢固平稳水泥台或木台上，室内要求清洁、干燥，同时应避免光线直接照射到天平上。（2）称量时应从侧门取放物质，读数时应关闭箱门以免空气流动引起天平摆动。（3）挥发性、腐蚀性、强酸强碱类物质应盛于带盖称量瓶内称量，防止腐蚀天平。（4）电子分析天平若长时间不使用，则应定时通电预热，每周一次，每次预热2h，以确保仪器始终处于良好使用状态。四、分光光度计不同物质对不同波长入射的吸收程度各不相同，从而形成各具特征的吸收光谱。根据这一原理，应用比色法可以对某些有色物质进行定性或定量分析。但由于比色法仅限于可见光区，而且精度低，已远远不能满足高精度微量分析的要求。随着科学技术不断发展，分析仪器也不断地更新换代，人们引进了分光光度法的概念，分光光度计随之应用。分光光度计由光源、单色器、吸收池、接受器、显示屏幕所组成，它不仅适应于可见光区，同时还扩展至紫外光区及红外光区。光密度（OD）是许多溶液中的溶质定量的指标之一，通过所产生的单色光6而测定某一溶液对该单色光的吸收值。分子生物学实验中常使用紫外分光光度计进行核酸溶液定量和纯度的初步判断。下面介绍紫外可见光分光光度计GeneQantTMPro（Amersham）的使用方法。该仪器除了能检测核酸样品浓度外，还可进行蛋白质浓度以及细胞培养液浓度的测定，能检测低至几微升样品（70µl和5～7µl），样品无需稀释，测量后还可全部回收。使用方法(1）打开电源开关（ON），等待数秒钟，显示屏上显示一系列数据，如本机型号、当前日期等，这些数据可以重新设置，当出现“instrumentReady”即可进入下一程序。(2）在仪器面板上有许多功能键，其中包括检测basesep、Tm、DNA、RNA、oligo、Protein595assay、Protein280meas、cellculture等。例如，欲检测DNA，按DNA键，即进入DNA检测程序。在显示屏上：Pathlengh10mmUnitsµg/µlUse320nmNODilutionFaotor1Insertreference,以上为仪器预设置的参考数据，若按“enter”键，和“select”键可以将以上的参数进行重新设定。(3）取石英样品杯70µl或5～7µl，容量大小根据需要。先用吸管吸高纯水入样品杯中，然后放入仪器上的样品槽中，放入时注意样品杯的光学面朝前方。(4)按“setref”键，进行空白测试。显示屏上出现一系列数据均“0.000”并提示插入样品“Insertsample”。将样品杯取出，吸干水分，稍干燥后，同样吸入待测样品，放入样品槽中进行测定。(5）一个样品测定完毕，按“stop”键，返回“InstrumentReady”。(6）取出样品杯，吸出样品，然后用高纯水洗几次，自然晾干。由于样品杯十分昂贵，使用时要小心操作。不能用手指拿样品杯的光学面，用后要及时洗涤，可用温水或稀盐酸，乙醇以至铬酸洗液（浓酸中浸泡不要超过15分钟），表面只能用柔软的绒布或拭镜头纸擦净。五、数字式酸度计酸度计是实验室配置溶液必备的仪器。本实验室的酸度计为台式微电脑酸碱度计和温度计（Hanna）,测量pH范围为0.00～14.00pH；温度为0.0～100.0℃；71.使用方法（1）将pH电极和温度探头与主机连接，主机与电源连接。（2）取出电极保护套，如果有结晶盐出现，这是电极常见现象，浸入水后就会消逝。如果薄膜玻璃或透析膜发干，可在HI170300电极保存液中浸泡1小时。（3）pH校准。将pH电极和温度探棒浸泡在所选的标准缓冲液内4cm（建议用pH6.86、7.01），缓冲液值可通过“D℃”或“Ñ℃”键来调节。按“CAL”键，仪器将显示“CAL”和“BUF”符号及“7.01”数据。当读数不稳定时，屏幕会显示“NOTREADY”；当读数稳定时，屏幕会显示“READY”和“CFM”，按“CFM”键确认校准值。确认第一校准点后，将pH电极与温度探棒浸泡在标准缓冲液内4cm（建议用pH4.01、9.18、10.01）；再按“CAL”键，仪器将显示“CAL”和“BUF”符号及“4.01”数据。按“CFM”键确认校正值。（4）pH测量。校准完毕后，仪器自动进入p