基因敲除技术最新研究进展报告(转基因技术及应用)摘要:基因敲除是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术,此后经历了将近20年的推广和应用,直到2007年10月8日,美国科学家MarioR.Capecchi和OliverSmithies、英国科学家MartinJ.Evans因为在利用胚胎干细胞对小鼠基因进行定向修饰原理方面的系列发现分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖,基因打靶技术才获得诺贝尔奖评审委员会的关注和肯定。本文就近年来基因敲除技术的研究进展作一个简单的综述。关键词:基因敲除、RNAi、生物模型前言:当今世界,科学技术发展突飞猛进,新兴学科、交叉学科不断涌现,科技进步对经济社会的影响作用日益广泛和深刻。伴随着信息科技革命方兴未艾的浪潮,生命科学和生物技术的发展也正在展现出未可限量的前景。越来越多的人们已经预见到,一个生命科学的新纪元即将来临,并将对科技发展、社会进步和经济增长产生极其重要而深远的影响。基因敲除技术就是在这样的环境下作为新兴的技术,迅猛的发展起来了。1.基因敲除技术简介基因敲除(Geneknockout)是指借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法,通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏,使特定基因失活,以研究该基因的功能;或者通过外源基因来替换宿主基因组中相应部分,以便测定它们是否具有相同的功能,或将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。基因敲除是揭示基因功能最直接的手段之一。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理,用设计的同源片段替代靶基因片段(即基因打靶),从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展,除了基因打靶技术外,近年来新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有RNA干扰技术,同样也可以达到基因敲除的目的。2.基因敲除技术国近年来发展概况(1)目前基因敲除的方法1)Red重组敲除系统将一段携带与吧基因两翼各有40~46bp同源序列的PCR片段导入宿主细胞,利用λ噬菌体Red重组酶的作用,使导入细胞的线性DNA片段与染色体(或载体)的特定靶序列进行同源重组,靶基因被标记基因置换下来。2)Cle-Loxp和Flp-FRT敲除系统Cle-Loxp系统是由HuaGu和JDMarth等人在1993年首先提出的。它包括Cre重组酶和loxP微点两部分,前者是来自E.coli噬菌体P1的cre基因编码,loxP由两个13bp的反向重复顺序和8bp的间隔区域构成。Cre重组酶可以介导34bp的重复单元,切除同向重复的两个loxP位点间的DNA片段和一个loxP位点,保留一个loxP位点。Flp-FRT系统与前者相同,也是由一个重组酶和一段特殊的DNA序列构成。(2)基因敲除技术在各研究领域的应用概况基因敲除技术现在以广泛的应用于各个领域并取得了快速的发展,应用此技术可以建立生物模型、培育新的生物品种、还可以用于疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗等。1)建立生物模型的研究基因敲除动物模型的建立,为研究人类疾病提供了一个崭新的方法,如:通过敲除小鼠的OA1基因用来研究人类眼球白化症。在药物依赖性研究中基因敲除技术也发挥了重要作用,利用基因敲除技术培育出了先天性缺失某一特定受体基因的动物用于研究该受体所发挥的作用,如:通过基因敲除技术培育出阿片μ、δ、κ三种亚型受体基因缺陷小鼠用于研究吗啡产生的精神依赖性史由什么受体介导的。2)在培育新物种的研究作为一项新兴的微生物育种技术,基因敲除克服了传统诱变方法的盲目性和偶然性,敲除后改变的基因会随染色体DNA进行复制,改良的菌种可以稳定地用于后续的研究和生产。这样的方法具有很强的目的性,大大节省了为生物技术研究的时间。3)疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗的研究在对罗格列酮对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化的影响的实验中发现,罗格列酮可以抑制动脉粥样硬化病变的发展;2010年张风河等应用敲除技术研究p75神经营养蛋白受体及印尼敲除对小鼠面神经损伤后神经再生的影响,结果发现可以增强面神经的再生。3.基因敲除技术与RNA干扰技术(RNAi)RNAi是近两年才发展起来的一种在RNA水平上研究及印尼功能的技术。将化学合成的双链RNA分子(dsRAN)或将能表达dsRNA的载体转导入体外或动物体的细胞内,dsRNA会介导受体细胞中序列特异的同源靶mRNA发生降解或受阻,引发受体细胞产生转录后水平的基因沉默,使之与相应的内源靶基因表达被阻抑,从而获得类似于基因敲除的基因阻抑效果。RNA干扰为基因和蛋白质学的研究等提供了崭新的技术方法,大有取代基因敲除技术的趋势。但是RNA干扰技术存在许多问题,使它不能完全替代基因敲除技术:一、RNAi不适用于所有的细胞,而基因敲除技术则可以作用于个体胚胎发育各个介段,能精确地敲除任何组织或器官的目的基因;二、RNAi在低等生物中能高效诱发基因沉默,但是在哺乳动物中,RNAi的抑制效果远远不如在低等生物体中那么明显,而基因敲除对哺乳动物的效果也是明显的;三、基因敲除得到的动物模型具有遗传性,能够进行繁殖而获得大量的基因敲除动物群体,有利于实验的延续,而RNAi的基因沉默是没有遗传性的。4.结语随着基因敲除技术的发展,早期技术中的许多不足和缺陷都已经解决,但其中始终存在一些难以解决的问题。基因敲除研究中存在的主要问题有:基因敲除的成功率很低,检测发生同源重组干细胞的工作比较困难;重定向敲除基因的动物中筛选出具备理想基因型的动物依旧耗时长;基因敲除后的功能可能被其他基因的代偿作用补偿而不表现出表型缺陷。参考文献[1]贺松、张德纯;基因敲除方法及其应用[J];中国微生态学杂志;2009年02期:181-184。[2]卢丽、陈系古、黄冰;基因敲除动物的研究和应用[J];中国实验动物学报;2006年02期:153-156。[3]张红岩、申乃坤、周兴;基因敲除技术及其在微生物育种中的应用[J];酿酒科技;2010年04期:21-25。[4]李樊、刘义、何钢;基因敲除技术研究进展[J];生物技术通报;2008年02期:80-82[5]王全海、刘琳;生物转基因技术对人类社会发展的影响[J];时珍国医国药2009年第10期:2652-2655。