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MiRNA与人类肿瘤关系摘要：microRNA又称miRNA,是真核生物细胞中固有的一类不编码蛋白的小分子RNA。生物体中,miRNA能够转录后调控基因的表达,影响着几乎所有的信号通路,参与多种生理病理过程,在肿瘤的发生和发展中也发挥了重要的调节作用。研究miRNA与肿瘤的关系是近年来备受关注的热点之一,其影响肿瘤发生和发展的作用机制将为肿瘤的诊断和治疗提供新的思路。关键词：微小RNA;肿瘤;基因调控;靶基因1.miRNA的介绍1.1miRNA的发现1993年,LeeRC等[2]在秀丽新小杆线虫(c.elegans)中意外地发现了一种定时调控胚胎后期发育的RNA,它是一种非编码RNA,长度为22nt，称为miRNA-lin4。2000年,miRNA-let7的发现掀起了寻找miRNA的热潮。近几年,随着生物信息学的发展,分子克隆技术的改进和模式物种cDNA文库的建立,相继又在线虫、果蝇、Hela细胞等许多真核模式生物和细胞中找到了数百种相似的小分子RNA,并将其称为miRNA(microRNA)。自从1993年发现了首个miRNA以来，miRNA被发现参与调节了众多的细胞功能与发育过程。这一小分子连续几年被国际分子生物学顶级杂志评为“十大科技突破之一”，也成为遗传、发育、癌症、干细胞等多个领域中的研究新热点。时至今日，已有约1000个动物的miRNA被报道，且约30%的基因被预测为miRNA的靶基因，能够被miRNA所直接调控。1.2miRNA的特点MiRNA广泛存在于真核生物中,是一组不编码蛋白质的短序列RNA,它本身不具有开放阅读框架(ORF);通常的长度为20～24nt,但在3′端可以有1～2个碱基的长度变化;成熟的miRNA5′端有一磷酸基团,3′端为羟基,这一特点使它与大多数寡核苷酸和功能RNA的降解片段区别开来；多数miRNA还具有高度保守性、时序性和组织特异性。1.3miRNA的生成及成熟过程体内外实验研究表明miRNA的生成至少需要两个步骤：1）由长的内源性转录本（pri-miRNA)生成70nt左右的miRNA前体（pre-miRNA)，该过程发生在细胞核;2)将pre-miRNA加工为成熟miRNA，该过程发生在细胞质。其具体过程为：miRNA基因在核内由RNA聚合酶II(polII)转录，产生大的具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴的pri-miRNA。pri-miRNA在核酸酶Drosha和其辅助因子Pasha的作用下被处理成70个核苷酸组成的pre-miRNA。RNA–GTP和exportin5将pre-miRNA输送到细胞质中。随后，另一个核酸酶Dicer将其剪切产生约为22个核苷酸长度的miRNA:miRNA*双链。这种双链很快被引导进入沉默复合体(RISC)复合体中，其中一条成熟的单链miRNA保留在这一复合体中。成熟的miRNA结合到与其互补的mRNA的位点通过碱基配对调控基因表达。2.miRNA与肿瘤的关系在过去10年里，随着癌症的分子分类学方法的发展，我们取得了许多成绩[3]，尤其是在22000种蛋白质编码转录产物中，mRNAs被用于人类多种癌症的分类。最近，发现了许多个小的非编码miRNAs[4]。第一个被确认的miRNAs是秀丽隐杆线虫基因lin-4andlet-7的产物，它在控制生物周期中起重要作用，并很有可能调控mRNA的翻译[5～7]。当lin-4或let-7被灭活，特种上皮细胞开始进行额外分裂而非正常分化。因为异常细胞增殖是癌症的标志，那么miRNA表达模式就有可能指示出肿瘤的恶性状态。事实上，在一些类型的肿瘤中，已经发现有些miRNA表达的改变[8～11]。最近的研究确实发现，miRNA表达与多种癌症相关，大约50%得到注解的miRNAs在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点（fragilesite）。这说明miRNAs在肿瘤发生过程中起至关重要的作用，这些miRNAs所起的作用类似于抑癌基因和癌基因的功能。2.1miRNA的分类2.1.1充当抑癌基因的MiRNAmir-125b-1，位于染色体的11q24脆性位点，乳腺癌、肺癌、卵巢癌、子宫癌病人中11q924位点常有缺失，而这一位点并不存在已知的抑癌基因。且65%B细胞慢性淋巴型白血病（CLL）病人，50%的套细胞淋巴瘤病人，16-40%的骨髓瘤病人、60%的前列腺癌病人中有13q14位点的缺失。因此，在这个30Kb的区域中必定有一个肿瘤抑制基因的存在。而mir-15a和mir-16-1位于这一区域中一个功能未知的被称为LEU2的非编码蛋白的RNA基因的内含子区域。Climmino等最近报道，miR-15a和miR-16-1负调控BCL2，一个抗凋亡基因，因此，这两个miRNAs的缺失或下调，导致了BCL2表达的升高，促进了白血病、淋巴瘤和前列腺癌的发生。还有研究报道，mir-143和mir-145在结肠癌中明显下调。有趣的是，其发夹结构的前体分子在肿瘤和正常组织中含量相似，这表明，可能是由于其成熟过程受到破坏。mir-143和mir-145的肿瘤抑制基因功能不仅仅局限于结肠癌，在乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、淋巴癌等细胞系中其表达量也明显下调。此外，Takamizawa等发现肺癌与let-7表达显著降低有关，会这导致这些病人预后更差。2.1.2充当癌基因作用的miRNAmiR-21在胶质母细胞瘤中表达增加。这个基因在肿瘤组织中表达量比正常组织高5-100倍。反义核酸的研究发现这个miRNA通过抑制凋亡而并非影响细胞增殖控制细胞生长，这预示着这个miRNA具有癌基因的功能。由于mir-21不是一个大脑特异性的基因，在乳腺癌样品中表达也有增加，这个基因可能在肿瘤发生中起到广泛的作用。Metzler等人发现，在BIC基因上具有一段138个核苷酸的保守序列，编码mir-155的发夹结构。该研究组还发现在Burkitt淋巴瘤中，miR-155表达量上升了100倍，此外的研究也发现，Hodgkin淋巴瘤等肿瘤中miR-155水平也有提高。因此，mir-155可能是作为一个癌基因和MYC协同作用，而其正常功能是在B细胞的分化中起作用，其可能的靶基因是那些对抗MYC信号通路的基因。He等人发现在散布的B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、套细胞淋巴瘤等肿瘤中常常与13q31位点的扩增有关。而在甲状腺癌、结肠癌、宫颈癌、胰腺癌等实体瘤中，miR-155高表达，预示预后不良。miR-155在急性髓性白血病M4、M5型中、慢性淋巴细胞白血病表达增加。Nikiforava等检测甲状腺癌的乳头状型、滤泡状癌型、末分化癌型中，miR-155表达分别上调9.5、5.5、13.2倍。2.2因此，miRNA与肿瘤细胞的分化、与肿瘤细胞的增殖和凋亡以及肿瘤细胞的侵袭与转移有很大的关系2.2.1miRNA与肿瘤细胞的分化细胞分化是受基因高度精细调控的过程。EisPS等[12]发现编码lin-28蛋白的mRNA3'UTR和let-7a、miR-125b以及miR-218的碱基互补配对,而lin-28蛋白在胚胎癌性细胞和NT2/D1神经细胞发育过程中表达水平逐渐下降,与此同时,let-7a,miR-125b和miR-218在胚胎癌性细胞和NT2/D1神经细胞发育过程中表达水平逐渐升高。这提示,编码lin-28蛋白的mRNA可能是let-7a,miR-125b和miR-218的靶mRNA。let-7a,miR-125b和miR-218可能通过调节lin-28Mrnade表达控制NT2/D1神经细胞分化和发育。2.2.2miRNA与肿瘤细胞的增殖和凋亡肿瘤的发生是细胞增殖、凋亡和分化失衡的结果。研究显示,miRNA既可以促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,又可以抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。EisPS等[12]在B细胞淋巴瘤的研究中发现,在各种类型的B细胞淋巴瘤组织miR-155的表达较正常组织高10～30倍,而恶性程度高、预后较差、弥散性大的B细胞淋巴瘤miR-155增高尤为显著。miR-21在人类恶性胶质瘤组织中高表达,抑制miR-21的表达后,肿瘤细胞凋亡明显增加,而与凋亡密切相关的胱酰蛋白酶-3和胱酰蛋白酶-7活性增加了3倍[13]。miRNA不但可以促进肿瘤发生发展,而且可以抑制肿瘤的生长。在肺癌组织和肺癌A549细胞中,let-7表达均显著降低,将let-7a和let-7f转染入A549细胞中,细胞增殖受抑制,而且let-7f的抑制作用更为显著[14]。2.2.3miRNA与肿瘤细胞的侵袭与转移恶性肿瘤细胞的侵袭与转移是恶性肿瘤导致死亡的主要原因之一。miRNA不仅参与肿瘤的生长过程,在侵袭和肿瘤转移过程中也具有重要作用。YuSL等[15]研究发现,miR-137,182,372能促进肺癌细胞的侵袭,miR-221能够抑制细胞的侵袭。ZhuS等[16]发现,mir-21在转移型乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞中,将转染anti-mir-21在MDA-MB-231细胞注入年轻的雌性裸鼠体内后,与转染阴性对照的裸鼠每个肺中的转移灶(22个)相比较,注有anti-mir-21细胞的小鼠的肺中转移灶(2个)显著降低,而且这种抑制作用可能是通过调控PDCD4和maspin来实现的。3.面临的挑战3.1如何寻找miRNA分子信息学的方法：应用计算机的方法如MirScan来寻找miRNA分子在线虫及脊椎动物体内取得了巨大的成功。验证miRNA在组织细胞内的表达，目前常用来检测miRNA的技术主要有以下几种：Northern杂交;原位杂交;Stem-loop实时定量RTPCR。这三种技术各有利弊，可以相互结合应用，来反映细胞内miRNA的真实表达水平。3.2如何寻找miRNA作用的靶细胞MIT的BartelandChrisBurge报道了一种可以用来探测miRNA与其作用的靶基因之间关系的新的计算机方法—TatgetScan。他们针对已知的每一个miRNA，扫描mRNA的数据库——DNA转译为蛋白的生化信息，搜索与miRNA匹配的片段，然后对miRNA与mRNA的匹配程度评分，推测在三个或以上物种中获得高分的mRNA为该miRNA的靶基因。3.3如何分离miRNA分子我们可以利用分子信息学筛选miRNA，其原理是：出发点为miRNA前体的发夹状结构及miRNA在物种间的保守性。miRNA基因可能定位于编码蛋白基因的内含子区域（有意义链或反意义链）及远离任何已知基因的基因间区域。有时几个发夹状结构以多顺反子的形式丛集在一起.提高寻找miRNA基因准确性的一些附加条件：1）上游和下游保守序列的数量；2）候选发夹状结构的上游高度保守模序的存在。4.展望虽然,人类对miRNA的研究在肿瘤学领域已取得一些进展,但仅是冰山一角,仍需深入与广泛研究。miRNA与肿瘤关系的研究目前还面临很多问题。首先,miRNA的加工过程复杂有序并且受多种因素精密调控。迄今为止,尽管已初步明确了miRNA的加工过程中的某些重要步骤,但其中具体的调控因素还不尽清楚。其次,miRNA存在时空表达特异性,不同类型肿瘤、同一类型肿瘤的不同阶段miRNA表达存在高度时空特异性,还有待研究。最后,最新研究报道发现,与以往miRNA调控靶基因的作用机制不同,miRNA也可以作用于靶mRNA的5'-UTR而促进该基因的翻译[17-18]。还有报道表明,miRNA还可以作用于靶mRNA的蛋白编码区抑制该基因的翻译[19]。因此,miRNA调控靶基因的作用机制比以往的更为广泛而复杂。现在的技术日新月异，相信新技术的发展必将为肿瘤学的研究,肿瘤的诊断和治疗掀开崭新的篇章。参考文献[2]LeeRC,FeinbaumRL,AmbrosV.TheC.elegansheterochronicgenelin-4encodessmallRNAswithantisensecomplementaritytolin-14[J].Cell,1993,75(5):843-854.[3]LeeY,AhnC,HanJ,etal.ThenuclearRNaseII