PCR仪的原理和使用

1PCR仪的原理和使用2PCR原理•聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)•80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。•优点：特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等•能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；•可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑3PCR技术简史•本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术•Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。4发展•1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。5实现•Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，•其缺点是：•①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。•②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。6改进•1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。7完善•1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。•特点：•①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。•②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。•③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。8•由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶IKlenow片段区别，将此酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。9PCR技术基本原理•PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，•其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。•PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成10基本步骤•①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；•②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；11•③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链12•重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。•每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。13PCR的反应动力学•PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。•DNA扩增量可用Y＝(1＋X)n计算•Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。•平均扩增效率的理论值为100%14•反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式•随着PCR产物的逐渐积累，进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，•这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。15PCR反应体系与反应条件•标准的PCR反应体系：•10×扩增缓冲液10ul•4种dNTP混合物各200umol/L•引物各10～100pmol•模板DNA0.1～2ug•TaqDNA聚合酶2.5u•Mg2+1.5mmol/L•加双或三蒸水至100ul16PCR反应五要素•引物、酶、dNTP、模板和Mg2+•引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。17•Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。18PCR反应条件的选择•温度、时间和循环次数•温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。•在标准反应中采用三温度点法，1.双链DNA在90～95℃变性，2.再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，3.然后快速升温至70～75℃，19循环次数•循环次数决定PCR扩增程度。•PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。•一般的循环次数选在30～40次之间，•循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。20PCR反应特点1.特异性强–①引物与模板DNA特异正确的结合；–②碱基配对原则；–③TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；–④靶基因的特异性与保守性。2.灵敏度高3.对标本的纯度要求低21分析方法•凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。22•琼脂糖凝胶电泳：通常应用1～2%的琼脂糖凝胶，供检测用。•聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。23•酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。•分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变的有效方法。24•Southern印迹杂交：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。25•斑点杂交：将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。