第十一章--革兰氏阴性需氧杆菌

第十一章革兰氏阴性需氧杆菌重要的革兰氏阴性需氧杆菌布氏杆菌属伯克氏菌属假单胞菌属波氏菌属弗朗西斯菌属第一节布氏杆菌属（Brucella）布氏杆菌是多种动物和人布氏杆菌病的病原。该菌不仅危害畜牧生产，而且严重损害人类健康，因此在医学或兽医学领域都极为重视。一、主要生物学特性（一）形态及染色球杆状或短杆状，长0.6～1.5μm，多单在。不形成芽孢和荚膜，无鞭毛不运动。革兰氏染色阴性。柯氏染色法布氏杆菌呈红色，其他菌呈绿色或蓝色。布氏杆菌（二）生长要求与培养特性生长要求•初代分离营养要求较高，培养基中常需加入血清、血液、肝汤、葡萄糖或泛酸钙和赤藓醇等。•需氧，适温37℃，最适pH6.6～7.4。•流产布氏杆菌和绵羊布氏杆菌初代分离时尚需5％～10％CO2环境。培养特性初次分离时生长缓慢，需5～10d甚至20～30d才能长出菌落，但实验室传代保存的菌株，培养48～72h即可生长良好。肝汤肉汤呈轻微浑浊生长，无菌膜。但培养日久，可形成菌环。血清肝汤琼脂形成无色透明、隆起、光滑、湿润、有光泽、边缘整齐的圆形小菌落。直径0.5～1.0mm。（三）生化反应本菌能分解尿素，能产生硫化氢。根据不同生物型产生硫化氢的情况、脲酶作用时间和对碱性染料抑制作用的敏感性不同，可鉴别不同种型的布氏杆菌。（四）种和生物型种型流产布氏杆菌（Br.abortus）1、2、3、4、5、6、7型马尔他布氏杆菌（Br.melitensis）1、2、3型猪布氏杆菌（Br.suis）1、2、3、4、5型绵羊布氏杆菌（Br.ovis）1个沙林鼠布氏杆菌（Br.neotomae）1个犬布氏杆菌（Br.canis）1个田鼠布氏杆菌（Br.microti）？牛布氏杆菌（Br.ovis）？海豹布氏杆菌（Br.pinnipediae）？海豚布氏杆菌（Br.cetacease）？（五）抗原性布氏杆菌具有A和M两种表面抗原，两者的含量在不同的种型间有差异。流产布氏杆菌以A抗原为主，马尔他布氏杆菌以M抗原为主，而猪布氏杆菌两种抗原含量相近。A抗原和M抗原分别能与相应的单相抗血清发生凝集反应。可用凝集试验鉴别两种不同的抗原。二、致病性•本菌致布氏杆菌病，可感染60多种动物，包括人类、各种家畜、野生哺乳动物、啮齿动物、鸟类、爬虫类、两栖类和鱼类。•细菌通过皮肤、口腔、眼结膜、阴道粘膜等部位侵入体内。•多数动物为隐性感染。•实验动物中，豚鼠最易感，小鼠和家兔也可感染。本病特征母畜生殖器官和胎盘发炎，引起流产、不孕和多种组织的慢性炎症（如慢性子宫内膜炎、乳房炎、关节炎等）。公畜睾丸炎、副睾炎幼畜关节炎流产母牛从阴道排出污灰色或棕红色有恶臭的分泌物病母牛流产，产出发育较为完全的死胎病牛流产，产出发育不全的胎儿，全身肿胀，有出血斑流产的胎儿及胎衣胎衣水肿增厚，呈胶样浸润，子叶上有出血感染羊阴囊胀大、水肿病公猪睾丸肿大病猪睾丸萎缩病猪关节肿胀三、微生物学诊断布氏杆菌病常表现为慢性或隐性感染，其诊断和检疫主要依靠血清学检查及变态反应检查。细菌学检查仅用于发生流产的动物和其他特殊情况。（一）细菌学检查1、病料流产胎儿的胃内容物、胎盘、羊水、阴道分泌物、乳汁和尿液等。2、诊断方法病料柯氏染色涂片镜检分离培养纯培养鉴定豚鼠血清抗体（二）血清学检查1、用已知抗体检测抗原用已知抗体检查病料中的布氏杆菌，或鉴定分离菌是否为布氏杆菌可用：荧光抗体技术反向间接血凝试验间接炭凝集试验免疫酶组化法2、用已知抗原检测抗体动物感染该菌7～15d出现抗体，检测抗体是布病诊断和检疫的主要手段。方法：玻板凝集试验虎红平板凝集试验乳汁环状试验试管凝集试验补体结合试验试管凝集试验操作按检疫规程进行。•牛、马、骆驼血清凝集价1:100时判为阳性，1:50为可疑。•羊、猪、狗等血清凝集价1:50为阳性，1:25为可疑。可疑病畜于3～4周后采血重检，如仍为可疑反应，牛、羊即可按阳性处理；猪、马则须视情况而定。虎红平板凝集试验取被检血清和虎红平板抗原各0.03ml，滴加于玻板上，混匀，在4～10min内出现任何程度凝集者即为阳性反应。乳汁环状试验为检查新鲜乳汁中抗体的方法，操作简便，准确性较高，常被用于畜群布氏杆菌病的监测。补体结合试验特异性和敏感性均较凝集试验高，是慢性布氏杆菌病一种可靠的诊断方法，已作为世界各国清除病畜的必要手段。规定1:10被检血清阻止溶血在50％以上，即为阳性反应。因补体结合反应的操作方法复杂，只在特殊情况下才应用。（三）变态反应检查•变态反应现象一般在感染后的20～25d出现，因此不宜作早期诊断。本法适合于动物的大群检疫，主要用于绵羊和山羊，其次为猪。•检测时，将布氏杆菌水解素0.2ml注射于羊尾根皱襞部或猪耳根部皮内，24及48h后各观察反应一次。若注射部发生红肿，即判为阳性反应。此法对慢性病例的检出率较高。四、免疫防治我国目前用的疫苗：M5弱毒活菌苗可用于牛、羊和鹿布病的预防。皮下注射或气雾免疫。免疫期羊1年半，牛、鹿各为1年。M90弱毒活菌苗同M5弱毒活菌苗。S2弱毒活菌苗可用于猪、羊、牛等动物，甚至可以接种怀孕动物而不引起流产。免疫方法采用饮水、气雾和皮下注射3种。免疫期猪为1年，牛和羊均为2年。第二节伯克氏菌属（Burkholderia）是新建立的一个属，该属成员来自假单胞菌属Ⅱ群，现有30多种细菌，对人畜致病的主要有鼻疽伯克氏菌及伪鼻疽伯克氏菌。一、鼻疽伯克氏菌（B.mallei）鼻疽伯克氏菌，原名鼻疽假单胞菌，惯称鼻疽杆菌，为马、骡、驴等单蹄兽鼻疽病的病原体，也能感染人及其他家畜和多种野生动物。此病可呈急性或慢性经过，病变特征为皮肤、鼻腔粘膜、肺脏及其他实质器官形成典型的鼻疽结节和溃疡。（一）形态及染色G－中等大小杆菌，无芽孢、无荚膜、不运动。单独散在。美蓝染色可见异染颗粒，是本菌的形态特征。（二）生长要求及培养特性生长要求专性需氧，普通培养基中生长缓慢，加入适量甘油、血红蛋白、血液、血清或葡萄糖可促进生长，适温37℃，最适pH为6.4～6.8。培养特性甘油肉汤均匀浑浊生长，并逐渐形成灰白色粘稠沉淀，10～15d后液面形成灰白色菌环或菌膜。甘油琼脂24～48h后，形成灰白色至灰黄色中等大小菌落，直径2-3mm。马铃薯琼脂斜面：48h后，可出现棕黄色蜂蜜样的粘稠菌苔，随着时间的延长色泽逐渐变深。（三）致病性•本菌在自然条件下主要感染马、骡、驴等单蹄兽，引起鼻疽病。•骆驼、犬、猫等家畜以及狮、虎、豹、狼、狐、貂等野兽也可感染。牛、猪、绵羊、山羊及禽类不感染。•人类偶尔也可经创伤或吸入含菌材料而受感染，并引起致死性疾病。•实验动物猫和仓鼠最易感，豚鼠次之。•接种细菌于雄性豚鼠腹腔后可引起典型的睾丸炎，睾丸肿胀化脓而后破溃，此反应称为：Strauss反应，具有一定诊断价值。Strauss反应（四）微生物学诊断•包括细菌学检查、血清学检查和变态反应检查。•在进行大规模检疫时主要采用临床检查、变态反应和补反相配合的检查方法，其中任何一种呈阳性，都定为鼻疽病马。•而细菌学检查只有在特殊病例才被应用。1、变态反应检查•是鼻疽诊断和检疫最常用的方法，所用诊断试剂为鼻疽菌素（mallein）。•马感染鼻疽菌后2～3周,对鼻疽菌素呈现阳性反应，以后随着病程的发展反应逐渐增强。病马保持变态反的时间有的可达8～10年，甚至终生。因此，该方法在鼻疽诊断、检疫和流行病学调查上是一种必不可少的手段。变态反应诊断点眼反应眼睑试验皮下试验皮肤试验喷雾诊断其中以点眼法最为常用。为我国检疫规程主要采用方法。点眼法是将鼻疽菌素3～4滴滴入马匹一则眼结膜囊内，分别于点眼后3、6、9及24h观察反应。如眼结膜红肿并排出脓性分泌物，即为阳性反应；结膜无反应或轻度潮红、流泪或有少量的粘性分泌物判为阴性。•点眼法操作简便，特异性和检出率都很高，无论是对急性、慢性以及开放型和隐性感染的马匹均可检出。故此法最适合于畜群大批检疫，尤其是以5～6d的间隔反复点眼，检出率更高。所以点眼一般连续3次，每次间隔5～6天。•点眼法对骡子的检出率较低。驴的眼结膜对鼻疽菌素不敏感，一般检不出。此外，1～2的幼马驹眼结膜对鼻疽菌素也不敏感。马、骡三次点眼检出率第一次（%）第二次（%）第三次（%）马60～709598骡16.960.789.32、血清学检查常用补体结合反应。此法特异性很高，凡补反呈阳性的马，剖检时95％～99％都有鼻疽病变。但本反应检出率较低，只能检出大多数活动型鼻疽马；而对于点眼阳性但无临床症状的马只能检出10％～25％左右。因此，补反只能作为鼻疽菌素点眼的一种辅助诊断方法，用来检出其中的活动型病马，而不能代替鼻疽菌素点眼试验。五、免疫防治对于鼻疽免疫，迄今为止还没有研制出可供实用的有效菌苗。一般防制措施是采用全面检疫，然后将检出的开放性鼻疽病马予以扑杀或隔离治疗后划地使役，将检出的非开放性阳性病马划地隔离使役，并培养健康幼驹以更新畜群。第三节假单胞菌属(Pseudomonas)假单胞菌为专性需氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。本属细菌种类繁多，广泛存在于土壤、水、植物及腐物中，多为条件致病菌，与多种食物的腐败有关。与动物疾病有关的主要有铜绿假单胞菌。一、铜绿假单胞菌•铜绿假单胞菌（P.aeruginosa），惯称绿脓杆菌，因能产生绿色水溶性色素，感染创口时可形成绿色脓汁而得名。•本菌分布广泛，土壤和水中、人畜肠道及皮肤亦有存在是化脓性感染及烧伤感染的常见菌。（一）主要生物学特性•革兰氏阴性杆菌1.5-3.0μm，无芽孢，一端单鞭毛•专性需氧，营养要求不高•最适温度30-37℃，42℃生长，37℃不生长。•产生荧光素和蓝绿色水溶性绿脓素，培养物呈蓝绿色。•培养物有生姜气味。（二）致病性•本菌能感染多种动物能，包括哺乳类、禽类、爬行类和鱼类。马流产、化脓性肺炎猪坏死性肺炎、坏死性肠炎绵羊“绿毛病”牛创伤性心包炎、犊白痢、牛乳腺炎兔、豚鼠、小白鼠等实验动物易感，局部脓肿，败血症人类感染多继发于烧伤、外伤等（三）微生物学诊断1、细菌学诊断2、PCR技术诊断第四节泰勒菌属（Taylorella)本属细菌为革兰氏阴性球杆状细菌，包括2个种：马生殖道泰勒菌(T．equigenitalis)驴生殖道泰勒菌（T．asinigenitalis）前者过去归于嗜血杆菌属，旧名为马生殖道嗜血杆菌，致马化脓性子宫炎。后者新近在美国报道，未发现有致病性。一、主要生物学特性•菌体常为球杆状，大小为0.8μm×0.5μm。•革兰染色阴性，两级着色。•兼性厌氧，无运动力。•不溶血。•对营养要求苛刻，培养困难，生长缓慢。•用马血巧克力琼脂置CO2中培养，48h可见直径小于1mm的细小、灰白色菌落，继续培养，菌落直径可增至2-3mm。•麦康凯培养基不生长。二、致病性•马生殖道泰勒菌自然条件下只感染马。引致马化脓性子宫内膜炎、宫颈炎和阴道炎。主要通过交配和人工授精传染。•母马感染后数日内即发生化脓性子宫炎，排出大量脓性分泌物，当子宫内膜康复后数周至一年，仍可从阴道内分离到本菌。母马表现为暂时性不育，怀孕母马偶尔在怀孕60d内流产，也可产下活的带菌马驹。•公马的包皮带菌，但无症状。三、微生物学诊断1、镜检•可取患病母马的子宫排出物涂片、镜检。2、分离鉴定•取流产胎儿组织、母马子宫和阴道分泌物、公马包皮粘液或精前液，在48h内接种马血巧克力等特殊培养基，置37℃含10％CO2的温箱培养7d，逐日观察。•进一步鉴定应做生化试验及用相应抗体做玻板凝集试验。3、PCR法•检出率高、快速，仅需6h出结果，还可鉴别两种泰勒菌。4、血清学检查•急性感染母马在感染后3～7周出现补体结合抗体，但带菌母马通常阴性，带菌公马根本不产生补体结合抗体，故用补体结合试验做流行病学回顾性调查并不可靠。