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专题5课题3体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。1、主要概念：①凝胶色谱法②电泳法③缓冲溶液④它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2、主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理②电泳法分离样品的原理③缓冲溶液的组成和作用机理3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法4、课题难点：①样品的预处理②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。本课题学习目标水分固体物质血液血浆血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白两个α—肽链两个β—肽链四个亚铁红素基团思考与讨论血液有哪些成分？血浆蛋白无机盐磷脂葡萄糖等血红蛋白的特点：血红蛋白两个α—肽链两个β—肽链四个亚铁红素基团1.分离生物大分子的基本思路：选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。2.蛋白质分离和提取的原理：根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。㈠.血红蛋白的提取和分离一、基础知识㈡.缓冲溶液1.概念:在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液pH值基本保持不变的混合溶液。2.缓冲溶液的组成举例：⑴.弱酸及其对应的盐:H2CO3——NaHCO3、CH3COOH——CH3COONa⑵.弱碱及其对应的盐:NH3。H2O——NH4Cl⑶.多元弱酸的酸式盐和其他所对应的次级盐:NaH2PO4——Na2HPO4、KH2PO4——K2HPO43.缓冲溶液的配制㈢.分离蛋白质的方法根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。⑴.概念：1.凝胶色谱法（分配色谱法）⑵.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程⑶.凝胶色谱法的原理—分子筛效应：当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。▲依据的特性是：蛋白质分子量的大小。凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。琼脂糖凝胶电泳示意图⑴.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.电泳：⑵.电泳原理：电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。⑶.常见电泳类型：①琼脂糖凝胶电泳②聚丙稀酰胺凝胶电泳③SDS——聚丙稀酰胺凝胶电泳迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小、形状。电泳迁移率完全取决于分子的大小。课外拓展：用SDS测定蛋白质分子量的方法使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。实践训练1.(多选)关于血红蛋白分子的叙述正确的是()A.两个α—肽链，两个β肽链，一个亚铁血红素基团B.两个α—肽链，两个β肽链，四个亚铁血红素基团C.亚铁血红素能与CO2结合D.血红蛋白在人体主要运输能源物质2.在凝胶色谱法分离蛋白质中，所用凝胶的化学本质是()A.糖类化合物B.脂质C.蛋白质D.核酸3.SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳中决定蛋白质或多肽移动速度的主要因素是()A.蛋白质分子所带的电荷B.蛋白质分子的形状C.蛋白质分子的相对质量D.缓冲溶液的pHCABC4.凝胶色谱法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是()A.改变蛋白质分子通过凝胶时的路径B.吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度C.将酶或细胞固定在凝胶中D.与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度5.在利用凝胶电泳法分离蛋白质时，一定要加入缓冲液，其作用主要是()A.使酶的活性最高B.使蛋白质的活性最高C.维持蛋白质所带的电荷D.使蛋白质带上电荷6.甲种蛋白质是由一条多肽构成，共有100个氨基酸；乙种蛋白质是由三条多肽构成，也含有100个氨基酸且种类和数量都相等，若有一凝胶色谱柱能分离出这两种蛋白质，则洗脱时()A.甲先被洗脱B.乙先被洗脱C.甲乙同时被洗脱D.无法判断ACB二、实验操作样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定1.样品处理：㈠.蛋白质提取和分离步骤㈡.凝胶色谱法分离蛋白质操作步骤思考：人们用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？答：鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，哺乳动物成熟的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。①洗涤操作：(1)红细胞的洗涤:②洗涤目的:去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。柜式离心机初次离心后的结果3次洗涤后的结果磁力搅拌器搅拌器转子搅拌器正在工作(2)血红蛋白的释放：(3)分离血红蛋白溶液：甲苯层（无色透明）；脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；杂质沉淀层（暗红色）。过滤：除去脂溶性物质沉淀层和杂质沉淀层。(4)透析(粗分离)：①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。利用透析袋透析透析过程动画演示2.凝胶色谱操作:⑴.凝胶色谱柱的制作：注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。⑵.凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择：②凝胶的前处理：③凝胶色谱柱的装填方法：注意：1.凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2.装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1.液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2.不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。50cm高装配好的凝胶柱⑶.样品加入与洗脱①调节缓冲液面②滴加透析样品注意：正确的加样操作是：1.不要触及并破坏凝胶面。2.贴壁加样。3.使吸管管口沿管壁环绕移动。③样品渗入凝胶床④洗脱⑤收集注意：在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功。开始进行层析收集得到的纯化后的蛋白思考下面的问题：1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？答：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。实践训练1.下列各项中，一般不影响在凝胶色谱法分离蛋白质中的分离度的是()A.层析柱高B.层析柱的直径C.缓冲溶液D.样品的分布2.蛋白质的提取和分离一般分为四步，即＿＿＿＿、＿＿＿＿、＿＿＿和＿＿＿＿＿。后三步常用的方法依次是＿＿＿＿、＿＿＿＿＿＿、＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。B粗分离纯化样品处理纯度鉴定透析法凝胶色谱法SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳2.试剂的配制：鉴定血红蛋白纯度。1.目的：①丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺:用去离子水配制29%（29g/100mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N,N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液。②十二烷基硫酸钠（SDS）:用去离子水配成10%的贮存液，于室温保存。③用于制备分离胶和浓缩胶的Tris缓冲液。④TEMED：作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。㈢.SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳⑤用去离子水配制10%过硫酸铵：作用是提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。⑥Tris—甘氨酸电泳缓冲液：25mmol/LTris，250mmol/L甘氨酸(pH8.3)，0.1%的SDS。⑦样品处理液：50mmol/LTris—HCl(pH6.8)，100mmol/LDTT(巯基苏糖醇)或用5%的巯基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚蓝，10%的甘油。⑧染色液：0.1%的考马斯亮蓝R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸。⑨脱色液：10%的甲醇和10%的冰醋酸。注意事项：1、由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。2、TEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。3、在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。①SDS-聚丙烯酰胺分离胶制备：用去离子水4.6mL，30%的丙烯酰胺2.7mL，1.5mol、pH8.8的Tris缓冲液2.5mL，10%的SDS0.1mL，10%的过硫酸胺0.1mL，TEMED0.006mL,混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5cm)，再在胶液面上小心注入一层水（约高2—3mm），以阻止氧气进入凝胶溶液。②分离胶聚合完全后（约30min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。⑴.根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板⑵.SDS—聚丙烯酰胺凝胶制备：3、电泳方法步骤③配制SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液用去离子水2.7mL，30%的丙烯酰胺0.67mL，1.0mol、pH6.8的Tris缓冲液0.5mL，10%的SDS0.041mL，10%的过硫酸胺0.04mL，TEMED0.004mL，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。⑶.样品处理：在电泳样品中按1∶1体积比加入样品处理液，在100℃温度下加热3min，以使蛋白质变性。⑷.浓缩胶聚合完全后（30min），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris—甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。⑸.加样：按顺序加样，加样量通常为10—25μL。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样品。⑹.电泳：将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm处，关闭电源。⑺.剥胶：从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位。⑻.染色：将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色1-2h。⑼.脱色：染色完毕，倾出染色液,换脱色液脱色3-10h，其间需多次更换脱色液至背景清楚。⑽.观察结果：SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。三、结果分析与评价㈠.你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？㈡.你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观