细胞工程

医学细胞生物学（配套教材）第十八章细胞工程CellEngineering学习目的和要求1.掌握细胞融合、细胞核移植、基因转移的原理及方法。2.掌握单克隆抗体的制备方法。3.熟悉大规模细胞培养的方法。4.了解细胞工程的应用。CellEngineering第十八章细胞工程第一节第二节中英文退出第一节细胞工程的主要相关技术一、大规模细胞培养二、细胞融合三、细胞核移植四、基因转移退出首页CellEngineering第十八章细胞工程细胞工程（cellengineering）：通过细胞融合或拆合、核质交换或核移植、染色体或基因转移以及经由细胞培养和筛选，按照人们预先的设计，产生出新的细胞，用于生产、医疗或研发。细胞工程概述退出首页CellEngineering第十八章细胞工程细胞工程概述根据不同的操作对象，细胞工程可分为：动物细胞工程植物细胞工程微生物细胞工程退出首页CellEngineering第十八章细胞工程细胞工程概述根据细胞拆合与重组的层次，细胞工程可分为：细胞整体层次：细胞培养和细胞融合细胞器层次：核移植分子层次：基因转移退出首页CellEngineering第十八章细胞工程一、大规模细胞培养大规模培养（bulkculture）:是指细胞的高密度或高浓度生长，培养容量在2L以上。目的：制备大量的细胞或特殊细胞产物。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程一、大规模细胞培养体系：悬浮规模培养；单层规模培养；方法：悬浮培养；固定化培养；微载体培养；三维细胞培养。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程悬浮培养(suspensionculture)：是指细胞在培养液中呈悬浮状态的生长和增殖的培养方法。适用范围：血液及淋巴组织细胞；无需贴壁生长的细胞系、肿瘤细胞；骨髓瘤及杂交瘤细胞。1.悬浮培养退出首页CellEngineering第十八章细胞工程一、大规模细胞培养用途：大量生产疫苗；细胞因子；某些特殊细胞的基因工程产物。1.悬浮培养退出首页CellEngineering第十八章细胞工程一、大规模细胞培养优点：设备简单；容积可选择性大；成本低；可连续收集细胞或其产物；传代时无需消化；细胞浓度均一，可调控；细胞产量较恒定。搅拌瓶培养退出首页CellEngineering第十八章细胞工程1.悬浮培养一、大规模细胞培养技术关键：不断震荡培养液以及连续进行气体交换。搅拌瓶培养退出首页CellEngineering第十八章细胞工程1.悬浮培养一、大规模细胞培养2.固定化培养固定化培养：使细胞限制或定位于特定空间位置的培养技术。适用范围：所有动物细胞。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程一、大规模细胞培养2.固定化培养系统：吸附法：让细胞在适当的条件下贴附在载体表面、中空纤维膜或培养容器表面。包埋法：将细胞包埋于多聚物等海绵状基质中。优点：细胞以较高密度在较小体积的培养液中生长，培养液易于更换及分析。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程一、大规模细胞培养填充式Nunc细胞工厂退出首页CellEngineering第十八章细胞工程中空纤维灌流退出首页CellEngineering第十八章细胞工程3.微载体培养微载体培养：让细胞吸附于微载体（microcarriers）表面进行生长与增殖的技术，也称微珠培养。材料选择条件：对细胞没有毒性，能够承受高压灭菌，可重复利用。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程一、大规模细胞培养3.微载体培养材料种类：交联葡聚糖、塑料基质、聚苯乙烯、明胶、玻璃介质、胶原或胶原涂层、纤维素、生物玻璃等。猴肾成纤维细胞在微载体表面上的生长退出首页CellEngineering第十八章细胞工程一、大规模细胞培养4.三维细胞培养三维细胞培养：将具有三维结构的不同材料作为载体，与各种不同种类的细胞在体外共同培养,使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长,构成三维的细胞载体复合物。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程一、大规模细胞培养4.三维细胞培养优点：建立细胞间及细胞与胞外基质间的三维结构联系；在细胞的基因表达及细胞功能表现上优于传统的二维培养；将单层细胞培养体系与组织器官及整体研究联系起来。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程一、大规模细胞培养二、细胞融合1.基本概念：细胞融合（cellfusion）：指2个或2个以上的细胞合并成1个细胞的过程，又称细胞杂交（cellhybridazation）。杂种细胞（hybridcell）：细胞融合所产生的细胞。同核体：基因型相同细胞的融合所形成的杂交细胞。异核体：基因型不同细胞的融合所形成的杂交细胞。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程二、细胞融合2.促融方法：病毒法：如灭活仙台病毒；化学法：如聚乙二醇（PEG）、溶血卵磷脂、油酸；物理法：如电穿孔术。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程3.杂交细胞的筛选方法抗药性筛选：常用HAT培养基。抗药性筛选退出首页CellEngineering第十八章细胞工程二、细胞融合3.杂交细胞的筛选方法营养缺陷筛选：利用某些细胞在缺乏某种营养成分的培养基中不能存活的特性进行筛选。温度敏感筛选：利用某些细胞含有温度敏感性基因的特点进行筛选的方法。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程二、细胞融合4.细胞融合技术应用细胞基础研究、细胞工程的重要工具，如生产单克隆抗体。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程二、细胞融合三、细胞核移植1.细胞核移植（nucleartransfer）通过显微操纵（micromanipulation）将一个细胞的细胞核移植到一个去核的卵母细胞内的技术过程。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程三、细胞核移植2.细胞核移植方法显微操作仪（micromanipulator）。化学药物：用细胞松弛素及离心方法去核，采用PEG使细胞核融进另一细胞或胞质体内。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程克隆羊的产生过程多利羊的成功克隆证明高度分化的成体体细胞核在成熟卵母细胞中仍然可以被激活，并且重新编程，体细胞核具有分化全能性。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程3.体细胞核移植的应用细胞工程领域：同种、异种间的动物克隆。同源克隆（homologouscloning）：将一个体的体细胞核植入同一个体的去核的卵母细胞中，将所获得的干细胞植入供核供体体内。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程三、细胞核移植3.体细胞核移植的应用细胞治疗价值：治疗性克隆：从内细胞团取得细胞，扩增及定向诱导分化后用于治疗某些特殊的疾病。生殖性克隆：体细胞核移植后，任其发育直至产生一个新个体。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程三、细胞核移植四、基因转移1.基因转移（genetransfer）概念将外源基因导入受体细胞并整合至受体细胞的基因组中，使之遗传性状及表型发生一定改变的技术。由此可选择出所需的新型细胞或新的个体。若外源基因不但能在动物体内表达，并且可以遗传，则该动物称为转基因动物（transgenicanimal）。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程2.转基因技术的步骤外源目的基因的选择与获取；将外源目的基因导入受体细胞；对整合有目的基因的细胞进行筛选、扩增及鉴定；若受体为卵细胞，则进行体外培育，并植入合适的动物子宫内；筛选并获得转基因动物。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程四、基因转移2.转基因技术的步骤退出首页CellEngineering第十八章细胞工程四、基因转移3.转基因的方法物理法：电穿孔法、显微注射法、裸DNA直接注射法等。化学法：磷酸钙共沉淀法、脂质体包埋法、DEAE-葡聚糖法等。生物法：病毒介导法、体细胞核移植法、精子载体法、胚胎干细胞转染法等。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程四、基因转移3.转基因的方法⑴磷酸钙介导的DNA转染原理及基本过程：将氯化钙与外源DNA混合，加入到含磷酸根离子的溶液中，形成钙-磷酸-DNA共沉淀物，该沉淀物被培养的细胞摄取，DNA整合入细胞基因组中最终得到表达。优点：操作简单，无需昂贵的设备。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程四、基因转移3.转基因的方法⑵脂质体介导的转染原理及基本过程：以一种多价阳离子脂质体作为载体，DNA可被脂质体包被形成复合物，该复合物可与培养细胞的细胞膜融合，DNA进入细胞，整合至受体细胞的基因组中并得以表达。优点：转染成功率高、适应性广，细胞毒性较低。缺点：比较昂贵，不利于大规模使用。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程四、基因转移3.转基因的方法⑶电穿孔法原理及基本过程：高浓度细胞悬液短暂地暴露于高电压时，DNA可通过高电压在细胞膜上所形成的小孔进入细胞，然后整合入细胞的基因组并得到表达。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程四、基因转移3.转基因的方法⑶电穿孔法适用范围：对化学法转移不敏感的细胞；悬浮细胞更适合。缺点：所需细胞及DNA数量多；不同细胞间的最佳转染参数差异较大，需进行实验条件摸索。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程四、基因转移3.转基因的方法⑷病毒转染法原理：通过病毒感染的途径将外源目的基因导入受体细胞。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程四、基因转移3.转基因的方法⑷病毒转染法常用方法：DNA病毒载体：为双链DNA病毒，不整合入人染色体，不会导致肿瘤发生。安全性好，适用的受体细胞广，外源基因在载体上容易高效表达。逆转录病毒载体：为单链RNA病毒，进入细胞后反转录为双链DNA，将外源基因整合入受体细胞的基因组退出首页CellEngineering第十八章细胞工程四、基因转移3.转基因的方法⑸显微注射法原理及基本过程：在显微操作仪下，通过玻质注射针将DNA迅速注入受精卵内，通常为注入雄性原核内或者在其附近，然后将受精卵移植至假孕动物的输卵管中，最后产生转基因动物。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程四、基因转移3.转基因的方法⑸显微注射法用途：制备转基因动物。缺点：实验装备显微操作仪较昂贵，操作人员必须经培训。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程四、基因转移第二节细胞工程的应用一、单克隆抗体的制备二、生产药用蛋白三、疾病的细胞治疗退出首页CellEngineering第十八章细胞工程一、单克隆抗体的制备单克隆抗体的概念：借助聚二乙醇将骨髓瘤细胞与分泌抗体的B淋巴细胞进行融合，得到杂交瘤细胞，由杂交瘤细胞产生的抗体即为单克隆抗体。杂交瘤细胞特点：如同骨髓瘤细胞那样无限生长；如同B淋巴细胞那样分泌抗体。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程一、单克隆抗体的制备单克隆抗体特点：对于特定抗原具有高亲和力和特异性。单克隆抗体的大量制备：体外（invitro）——离体悬浮培养；体内（invivo）——小鼠腹水。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程杂交瘤的产生退出首页CellEngineering第十八章细胞工程二、生产药用蛋白可利用细胞反应器或动物反应器生产1.哺乳动物细胞生物反应器定义：在人工条件下，高密度大量培养动物细胞并生产有应用价值的细胞蛋白质产品的技术及其设备。用途：生产疫苗、蛋白因子、免疫调节剂及单克隆抗体。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程二、生产药用蛋白2.动物生物反应器以转基因动物作为生物反应器。3.细胞反应器和生物反应器的优点投资少，污染少，工艺较简单，产品的特异性较高。退出首页CellEngineering第十八章细胞工程三、疾病的细胞治疗细胞治疗：将体外培养的具有正常功能的细胞植入患者