荧光定量PCR原理及操作步骤.

荧光定量PCRrealtime-PCR定量PCR反应体系①actin③achi⑤aly⑦vlg⑨stat②actin④achi⑥aly⑧vlg⑩stat模板cDNA4ulTagmixture10ul引物10.5ul引物20.5ulH205ul1♀模板2♂模板①③⑤⑦⑨443.45ng/ul686.75ng/ul②④⑥⑧⑩17.738ng/ul26.47ng/ul定量与常规PCR的差别•常规PCR技术：•对PCR扩增反应的终产物进行定量及定性分析定量PCR技术：通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析三个关键词：实时，定量，荧光PCR分四个阶段如何定量？•Ct值的概念•Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。定量原理确定初始模板的浓度初始DNA量越多,荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量起点定量与终点定量荧光化学SYBRGreen1TaqManTaqManSYBRGreenI工作原理•。SYBRGreen1结合到双链DNA的小沟部位•SYBRGreen1染料只有和双链DNA结合后才发荧光GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAAGTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAATACCGGGGTTACGAACGGTAAT未结合SYBRGreen1dye变性:无荧光信号SYBRGreenI应用范围•起始模板浓度定量•融解曲线分析–---可区分单一产物、变异产物、多种产物和（或）引物二聚体•基因型分析SYBRGreenI优点SYBRGreenI缺点PCR程序指南UNG酶使用原理金牌Tag酶活性参比荧光：管家荧光ROXROX校正效果96孔板设置举例PCR曲线标准曲线