荧光介绍及荧光显微镜的使用

荧光介绍及荧光显微镜的使用Leica图象分析仪组成部分•显微镜荧光显微镜可见光显微镜•成象系统照相机图象采集软件一、荧光显微镜的使用优点：•检出能力高•对细胞的刺激小•能进行多重染色用途：•物体构造的观察•荧光的有无、色调比较进行物质判别•发荧光量的测定对物质定性、定量分析•物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。•即：物质吸收短波光，发射出的长波光。•一种光化荧光什么是荧光?荧光的种类自发荧光：物质受光激发产生的固有荧光二次荧光：物质借荧光色素受光激发产生的荧光自发荧光二次荧光荧光的性质•吸收光•保持固有的荧光特性•荧光波长＞激发波长•荧光强度极小于激发光的强度•有不同程度的衰减•荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率荧光显微镜的种类透射式落射式荧光显微镜的主要部件落射式•汞灯光源•激发滤色镜•分色镜•吸收滤色镜透射式•汞灯光源•激发滤色镜•暗场聚光镜•吸收滤色镜落射荧光显微镜原理汞灯激发滤色镜分色镜吸收滤色镜物镜标本透射荧光显微镜原理目镜吸收滤色镜物镜暗场聚光镜激发滤色镜汞灯荧光激发滤色块透过能使标本产生荧光的特定波长的光，同时阻挡对激发荧光无关的光。几种主要的荧光激发滤色块激发方法代号主波长紫V405nm兰B，B2495nm绿G546nm荧光显微镜标本制作要求（一）载玻片•载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。（二）盖玻片•盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。•（三）标本•组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。•（四）封裱剂•封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/lpH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。•（五）镜油•一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替。单细胞悬液制备制胶片DNA碱解旋电泳中和细胞裂解染色与观察单细胞凝胶电泳试验（彗星试验）对照组与实验组中肺泡巨噬细胞DNA迁移的实验图象DAPI+FITC+TexasRed二、可见光显微镜的使用•光源在显微镜下方，不需要开汞灯•可以观察载玻片上的任何物质三、成象系统1、照相机2、图象采集软件Leica100图象分析软件，把显微镜下看到的图象拍摄下来，保存成图片文件，再进行相关分析。使用要点•标本制作•正确选择滤色镜•200W的超高压汞灯作光源，需预热15分。寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。•防止污染（载物台已被EB污染）•染色后尽快观察，荧光逐渐减弱测试题1、该仪器由哪几部分组成？2、什么是荧光？荧光有几种类型？有什么性质？3、该仪器的使用要点有哪些？4、荧光显微镜分哪两种？谢谢大家！欢迎提出宝贵意见！