淀粉糊化度测定方法的研究进展_黄立兰

SILIAOGONGYE2014年第35卷第13期总第466期淀粉的糊化是指淀粉悬浮液在一定温度下，淀粉颗粒吸水膨胀，体积增大，淀粉颗粒破裂，成为黏稠状胶体溶液的过程。糊化的本质是淀粉中晶质与非晶质态的淀粉分子间的氢键断开，微晶束分离，形成一种间隙较大的立体网状结构，淀粉颗粒中原有的微晶结构被破坏。糊化度是指淀粉中糊化淀粉与全部淀粉量之比的百分数。淀粉的糊化度越高，越容易被酶水解，有利于消化吸收。淀粉糊化度是评价颗粒饲料加工质量的重要指标，直接影响畜禽吸收利用饲料中能量物质的效率，进而影响饲料的转化效率和畜禽生长性能。淀粉糊化作用是饲料加工过程中重要的物理化学特性变化过程，而快速准确检测和实时监控饲料加工中原料淀粉糊化特性的变化，对提高饲料加工及产品质量，降低生产成本具有十分重要的意义。淀粉糊化度及糊化参数的测定，一般是根据淀粉糊化后其物理或化学特性的变化特点，如双折射现象消失、颗粒膨胀、透光率及黏度变化等等。目前，主要的研究方法有酶水解法、黏度测定法、双折射法、DSC技术、近红外光谱分析技术、X-衍射以及核磁共振光谱技术等。饲料行业中普遍采用与畜禽消化功能接近的酶水解法，以熊易强糊化度测定方法较为普遍。本文拟对淀粉糊化度测定方法的研究进展情况作一综述，为淀粉糊化度的快速准确的测定方法的建立提供依据。1酶水解法酶水解法的基本原理都是利用各种酶对糊化淀粉和生淀粉有选择性的分解，通过对生成物的测量得到准确的糊化度。1977年，Chiang等使用葡萄糖淀粉酶和邻甲苯胺试剂对淀粉的糊化度进行测定，以部分糊化淀粉的吸收率与全糊化淀粉的吸收率的比值求出糊化度。在样品溶液中加入葡萄糖淀粉酶，40℃保温30min后，用25%的三氯乙酸钝化葡萄糖淀粉酶，取上清液于试管中，加入邻甲苯胺试剂，沸水中放置10min，用冷水冷却，再加冰醋酸，在630nm下测定其吸收率。糊淀粉糊化度测定方法的研究进展■黄立兰黄广明劳晔（建明工业（珠海）有限公司，广东珠海519040）作者简介：黄立兰，硕士，主要从事饲料添加剂研究。收稿日期：2014-04-25摘要：在饲料的加工过程中，淀粉糊化度是一个重要的指标参数，其直接影响畜禽吸收利用饲料中能量物质的效率，进而影响饲料的转化效率和畜禽生长性能。文章总结了淀粉糊化度的测定方法，包括酶水解法、黏度法、热分析法、近红外光谱分析和脉冲核磁共振等，拟为淀粉糊化度的快速准确的测定方法的建立提供依据。关键词：淀粉；糊化度；酶水解法；热分析；黏度doi:10.13302/j.cnki.fi.2014.13.015中图分类号：S816.17文献标识码：A文章编号：1001-991X（2014）13-0053-05ResearchprogressofthemethodsofdeterminingthedegreeofstarchgelatinizationHuangLilan,HuangGuangming,LaoYeAbstract：Intheprocessoffeedprocessing,thedegreeofstarchgelatinizationisanimportantindexes,itaffectstheutilizationefficiencyofenergyinfeed,digestibilitycoefficientsoffeedandanimalperfor⁃mance.Thispapersummarizesdifferentmethodsondeterminingthedegreeofstarchgelatinization.Thesemethodsincludeenzymehydrolysismethod,viscositymethod,thermoanalysismethod,nearinfra⁃redreflectancespectroscopyandpulsednuclearmagneticresonance,andprovidesreferencesforestab⁃lishingarapidandaccuratedeterminationmethodofthedegreeofstarchgelatinization.Keywords：starch；gelatinizationdegree；enzymehydrolysis；thermoanalysis；viscosity53检测技术2014年第35卷第13期总第466期化度（Y）的计算方法为：Y=100×(B-K)A-KK=A×(C-B)A-2B+C式中：A=全糊化淀粉的吸收率；B=部分糊化淀粉和经过30min酶水解的完整淀粉混合物的吸收率；C=部分糊化淀粉和经过60min酶水解的完整淀粉混合物的吸收率；K=1%完整淀粉经30min水解后的吸收率。K对每种淀粉或特定处理的淀粉是一个常数，常规分析中只需测定1次。因葡萄糖淀粉酶可将糊化淀粉水解转化为葡萄糖，对葡萄糖的测定还可用碘-硫代硫酸钠滴定法。其原理为：葡萄糖在碱性溶液中被碘氧化成葡萄糖酸，过量的碘经酸化后用硫代硫酸钠滴定。反应式如下：I2+2OH-—IO-+H2O+I-CH2OH(CHOH)4CHO+IO-—CH2OH(CHOH)4COOH+I-IO-+I-+2H+—I2+H2OI2+2Na2S2O3—Na2S4O6+2NaI样品经酶水解产生葡萄糖的量与样品完全糊化后酶水解产生的葡萄糖量之比即为糊化度。在1983年，有人指出，葡萄糖淀粉酶对生淀粉和糊化淀粉之间的分解速度有着很大的差异，容易识别。但是，对糊化淀粉和老化淀粉间的识别较差。经研究，最终发现，对生淀粉完全不分解的β-淀粉酶和对支链淀粉的立体结构变化十分敏感的异淀粉酶的混合酶系对糊化淀粉和老化淀粉的分解性则存在相当大的差异，因此就发明了混合酶系法（BAP法）测定淀粉糊化度。反应生成的还原糖用Somogyi-Nelson法测定。Somogyi-Nelson法是测定样品的光密度，其糊化度的计算公式为：糊化度=被检液的光密度（或糖量）/完全糊化检液的光密度（或糖量）。此外，还有用β-淀粉酶和TaKa淀粉酶进行糊化度的测定。β-淀粉酶在适当的pH和温度下，能在一定的时间内，定量地将糊化淀粉转化为还原糖，转化的糖量与淀粉的糊化程度成比例关系，然后用铁氰化钾法测其还原糖量，即可计算出淀粉的糊化度。TaKa淀粉酶能在一定温度下将定量的熟淀粉在一定时间内转化成一定量的麦芽糖和葡萄糖，可根据生成的糖量计算出糊化度。Y.Xiong等对淀粉转葡糖苷酶法（AGS）测定加工谷物糊化度的方法进行了优化，从酶的浓度、显色剂、蛋白质沉淀剂、样品颗粒大小、震摇频率、缓冲液pH值等方面对方法进行了优化，并建立了葡萄糖释放量与糊化度间的标准曲线，由此可测定未知物的糊化度。熊易强提出了一种简易酶法，也是现在饲料界普遍采用的一种测定饲料糊化度的方法。其本质是对Y.Xiong等建立的AGS酶法进行了简化，以加工过的样品的葡萄糖释放量与同一来源的全熟化样品的葡萄糖释放量之比值来直接表达淀粉糊化度，即是在给定实验条件下淀粉酶解的有效率。其可以直接用光吸收的比值表达糊化度，不需要得知样品的葡萄糖释放量和样品的淀粉含量，进一步省去了建立葡萄糖标准曲线的步骤。不过此法所表达的淀粉糊化度，由于“零点”位置的改变，与Y.Xiong等建立的AGS酶法在概念和数值上都会有所差别，但却更为直接的表达了动物对淀粉的利用率。糊化度的计算公式为：糊化度（%）=（测定样品光吸收-空白光吸收）/（全糊化样品光吸收-空白光吸收）×100。DiPaolaR等提出用酶反应的初速度Vi表示糊化度，通过葡萄糖淀粉酶水解糊化淀粉得到葡萄糖，以葡萄糖浓度与反应时间作线性回归分析，从而得到Vi。其以10%浓度的生玉米淀粉悬浮液作为样品，通过不同温度的热处理，温度范围为25℃（未糊化）~95℃，得出不同糊化度的淀粉悬浮液，以制定温度与糊化度的标准曲线。并用DSC法和黏度法与Vi法进行比较，得出Vi与DSC的结果基本一致，相关系数r=0.97，P0.0001，与黏度法的结果的相关系数r也有0.78，P0.0001，由此表明用Vi表示糊化度可用于食品与饲料生产的常规质量控制。KeShunLiu等提出了一种酶法测定干物质糊化度的方法，并对该方法进行了考察、优化和验证。其利用AGS酶对淀粉进行水解得到葡萄糖，再用Mega⁃zymeGOPOD测定葡萄糖的含量，以表达糊化度。糊化度(%)=可水解淀粉的含量/全部淀粉的含量×100。此方法与以前的酶水解法的不同之处是要先将测试样品粉碎，降低样品颗粒的粒径，再用水溶解，即对样品进行机械增溶之后再进行酶水解，从而测定糊化度。由于AGS酶对生淀粉也有一定的水解能力，因此其以玉米、大米的全糊化淀粉和生淀粉作为样品考察54SILIAOGONGYE2014年第35卷第13期总第466期了样品的粒度、溶媒、磁力搅拌速度、搅拌时间、搅拌温度对糊化度的影响，最后得出的最优条件为样品粉碎过50目筛（孔径为300μm），加水溶解，50r/min的转速，室温磁力搅拌70min。此条件下，可最大限度的溶解糊化淀粉和降低生淀粉的溶解度。同时也对酶的量、酶反应时间、酶反应温度和缓冲液的pH值进行了考察，得出酶反应的最优条件为缓冲液的pH值4.75，加入10μl酶（33unit），37℃反应45min。最后用不同比例的糊化淀粉对方法进行验证，得出大米、小麦、大麦、燕麦和玉米的糊化淀粉的比例与所测得的糊化度成很好的线性关系，且RSD都小于5%。酶水解法的优点是准确度较高，但其缺点是繁琐、耗时长，不利于实际生产中现场测定和控制。试验中试剂的准备，尤其是酶溶液的制备，费用高、难控制，沸水浴中化学反应的沸液现象，试管的用量大，一组数据的测试时间在4~6h之间，在实时质量监控领域中的推广应用存在明显的局限性，并给饲料产品实际生产质量管理带来了很大不便。2黏度法淀粉糊化的黏度一般使用布拉班德黏度测定仪（BV）和快速黏度分析仪（RVA）测定。在淀粉糊化特性的研究中，BV的主要应用为评价淀粉糊化性质，其测定的数据可以判断淀粉的来源或区分淀粉的种类。BV能较为真实地反映淀粉糊化的实际情况，但耗时长，样品需要量大。RVA的出现，则大大加快了检测速度，且所需样品量少，灵活性强，可以测定绝对黏度。RVA是一种由计算机控制的快速旋转式黏度测试仪，其通过检测淀粉糊化过程中样品黏度的变化，实现对样品淀粉糊化特性的定性和定量分析。样品糊化度越高，RVA曲线越不明显。RVA曲线中用于评价样品黏度和糊化特性的参数包括冷峰值、冷峰面积、峰值黏度、保持黏度、最终黏度、峰值时间、衰减值和回生值。根据这些参数可以寻找出样品糊化度和黏度之间的定量关系。赵雅欣等利用SAS统计软件建立酶法测定的淀粉糊化度与RVA糊化图谱的7个特征值的相关性，得到线性回归方程：糊化度=57.09556186-2.30232088×冷黏度-0.13743669×峰值黏度+0.20335119×保持黏度+0.06400102×回升值-22.41192837×峰值时间+3.35366547×冷黏度面积，最终黏度=保持黏度+回升值。该模型预测结果与真值的相关系数R2=0.938176，说明预测值基本上等于真值，预测效果良好。但从所得的试验数据无法给出最终黏度与经典糊化度的函数关系，相关系数R2=0.470419，说明两者之间的相关性很小。王海东等以熊易强的简单酶法作为淀粉糊化度的参考测定方法，建立了快速黏度分析法测定颗粒饲料的淀粉糊化度。选用86个玉米使用量相近的乳猪颗粒饲料样品，探索建立样品糊化度和黏度之间的定量关系，得出回归方程：淀粉糊化度=0.4887-0.0067×冷峰值-0.0012×峰值黏度-0.0017×保持黏度+0.0009×最终黏度+0.00494×冷峰面积，R2为0.8025，并以此回归方程对其余20个样品的糊化度进行预测，决定系数R2为0.8746，表明通过建立的快速黏度分析法可以较准确地对样品的淀粉糊化度进行预测。可见快速黏度分析法测定淀粉的糊化度，可解决饲料