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1SDS-PAGE操作流程——考染1、准备溶液30%聚丙烯酰胺溶液-----30%（w/v）Acrylamide【组分浓度】各种组分名称配制不同体积所需各成分的体积(mL)或质量(g)30%Acr-Bis(29:1)1000ml100ml29%Acrylamide(丙烯酰胺)290g29g1%BIS(N,N’-亚甲丙烯酰胺)10g1g【配制方法】将29克丙烯酰胺和1克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml。0.45µm微孔滤膜过滤除菌和杂质，储于棕色瓶，4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。【保存条件】4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存【注意事项】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。1MTris-HCL（pH6.8）(浓缩胶buffer)【组分浓度】1MTris-HCL名称用量备注Tris12.1g去离子水80ml浓盐酸9ml(36%的浓盐酸)预实验已确定去离子水加入去离子水定容至100ml后，室温保存【配制方法】称量121.1gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加0.7mL的浓HCL调节所需要的pH值（7.4-大约0.7mL，7.6-大约0.6mL，8.0-大约0.42mL），将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。【保存条件】4℃保存。【注意事项】对人体有刺激性，请注意适当防护。1.5MTris-HCL（pH8.8）(分离胶buffer)【组分浓度】1.5MTris-HCL名称用量备注2Tris18.17g去离子水80ml浓盐酸3ml(36%的浓盐酸)预实验已确定去离子水加入去离子水定容至100ml后，室温保存【配制方法】1L称量181.7gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加浓HCL调节所需要的pH值=8.8，将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。（1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。）【保存条件】4℃保存【注意事项】应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。10%十二烷基硫酸钠SDS溶液-----10%(w/v)SDS【组分浓度】10%(w/v)SDS名称用量备注SDS10g去离子水80ml加入去离子水定容至100ml后，室温保存【配制方法】称取2g高纯度的SDS置于100~200ml烧杯中，加入约16ml的去离子水，68℃加热溶解，滴加浓盐酸调节PH至7.2，定容至20ml后，室温保存【保存条件】室温保存【注意事项】对人体有害，请注意防护。10%过硫酸铵溶液-----10%(w/v)AP【组分浓度】10%(w/v)过硫酸铵名称用量备注过硫酸铵0.1g去离子水1ml现配现用【配制方法】称取0.1g过硫酸铵置于1.5ml离心管，加1mL去离子水吹打溶解，4℃保存【保存条件】4℃保存【注意事项】10%过硫酸铵溶液在4℃保存时，可使用1周左右，超过期限会失去催化作用5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液-----5×Tris-Glycinebuffer（SDS-PAGE电泳缓冲液）【组分浓度】各种组分名称配制不同体积所需各成分的体积(mL)或质量(g)1000ml500ml0.125MTris15.1g31.25Mglycine(甘氨酸)94.0g0.5%(W/V)SDS5.0g【配制方法】称取15.1gTris，94.0g甘氨酸（glycine），5.0gSDS，用800ml蒸馏水或去离子水溶解，充分搅拌溶解，定容至1000ml，室温保存。得0.125mol/LTris-1.25mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释5倍。【保存条件】室温保存【注意事项】配制好的电泳液使用时间不宜超过两周。电泳缓冲液可以回收，回收后可再使用1-2次，但为了取得最佳的电泳效果，应使用新电泳液。5×SDS-PAGE加样缓冲液-----5×SDS-PAGELoadingBuffer【组分浓度】0.25MTris-HCL(pH6.8)；10%(W/V)SDS；0.5%(W/V)BPB(溴酚蓝)；50%(V/V)甘油；5%(W/V)β-巯基乙醇(2-ME)各种组分名称配制不同体积所需各成分的体积(mL)或质量(g)5ml3ml1MTris-HCL(pH6.8)1.25mlSDS0.5gBPB(溴酚蓝)25mg甘油2.5ml（0.5mL/份）分装，室温保存，使用前加25μL2-ME/小份，保存一个月左右。β-巯基乙醇(2-ME)0.25ml【配制方法】量取1.25mL1MTris-HCL（pH6.8），0.5gSDS，25mgBPB，2.5mL甘油，置于10mL塑料离心管中，加去离子水溶解后，定容至5mL，小份（0.5mL/份）分装，于室温保存。使用前将25μL的2-ME加入到每小份中。加入2-ME的LoadingBuffer可在室温下保存一个月左右。【保存条件】-20℃保存，至少一年有效。【注意事项】SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)中含少量DTT和巯基乙醇，有轻微刺激性气味，必须完全溶解后再使用。摘自Takara商品目录--实验室常规试剂配制方法TEMED原液直接使用考马斯亮蓝R-250染色液【组分浓度】0.1%(w/v)考马斯亮蓝R-250，25%(v/v)异丙醇，10%(v/v)冰醋酸各种组分名称配制不同体积所需各成分的体积(mL)或质量(g)1000ml400ml备注4考马斯亮蓝R-2501.0g0.4g异丙醇250ml100ml搅拌溶解，可用甲醇替代冰醋酸100ml40ml搅拌均匀去离子水650ml260ml搅拌均匀，滤纸除去颗粒物，室温保存考马斯亮蓝染色脱色液【组分浓度】10%(v/v)醋酸，25%(v/v)乙醇名称用量备注冰醋酸100ml乙醇250ml去离子水650ml充分混匀后使用2、实验步骤2.1.制胶2.1.1组装胶架将洁净、无水的玻片对齐，形成空腔，插入塑料框的凹槽中，注意箭头向上，并确保下端平齐。放于制胶架上夹紧，下端紧贴密封条。2.1.2分离胶的配置2.1.2.110%分离胶配方如下表：分离胶胶类型8%10%12%15%蒸馏水/ml4.3643.32.330%Acr-Bis(29:1)/ml2.673.3451.5MTris-HclPH8.8/ml2.52.52.52.510%SDS/ml0.10.10.10.110%APS/ml0.10.10.10.1TEMED/μl5555总体积/ml102.1.2.2灌胶混匀后用移液枪将凝胶溶液沿玻棒小心注入到长、短玻璃板间的狭缝内(胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm)。2.1.2.3液封在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水（或者75%乙醇）以隔绝空气，使胶面平整。静置约30min观察胶面变化，当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上层水，并用滤纸吸干残留的水液。2.1.3浓缩胶的配置2.1.3.15%浓缩胶配方下表：5%胶蒸馏水30%Acr-Bis(29:1)0.5MTris-HclPH6.810%SDS10%APTEMED6ml4ml1ml1ml0.080ml0.060ml0.008ml2.1.3.2插入制胶梳混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内(分离胶上方)，轻轻加入样品模5板梳，小心避免气泡的出现。约30分钟，聚合完全。2.2电泳2.2.1安装电泳槽将制备好的凝胶板取下，小心拔下梳子。两块10%的凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘与贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。倒入1×tris-gly电泳缓冲液。2.2.2样品处理对于蛋白样品直接取80µl的样品，依次加上20µl5×buffer(加了B-巯基乙醇)，混匀。对于菌体或组织等固体样品，取少量样品加100ul2×buffer(加了B-巯基乙醇)煮沸10分钟。2.2.3加样用移液枪取处理过的样品溶液10μl，小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内，marker加入到其中一个槽内，为区别两块板，marker可加在不同的孔槽中。2.2.4电泳将电泳槽放置电泳仪上，接通电源，正负极对好。电压调至约150v保持恒压。待溴酚蓝标记移动到凝胶底部时，关电源，把电泳缓冲液倒回瓶中。2.2.5剥离胶把电泳槽取出，两块板拿下来，用刮片从长短玻片中间翘起，取下。2.3染色放于加有R250染色液的染色皿中，染液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，完成后染液倒掉并用水洗掉染液。2.4.脱色取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里，脱色液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，本底色脱净，条带清晰可见即可，完成后倒掉脱色液。2.5拍照将脱色后的胶置于透明文件夹中，把胶上面的气泡赶出（用前也可用酒精棉球擦干净文件夹），放到胶片观察灯上，拍照。SDS-PAGE操作流程——银染1、固定：25mL醋酸，100mL甲醇，加入125mL超纯水，对凝胶中蛋白质进行固定60min（固定时间可延长，加一步水洗）。2、浸泡：75mL甲醇，0.5g无水硫代硫酸钠（强还原性），17g醋酸钠（28.18g三水合醋酸钠），加入165mL超纯水，（每10mL溶液中加入100uL稀释十倍的甲醛），30min。3、水洗：用超纯水洗三次，每次10min。64、银染：0.625gAgNO3溶于250mL超纯水中，20min。5、水洗：水洗两次，每次1min。6、显色：6.25g无水NaCO3溶于250mL超纯水中（每25mL溶液加入150uL稀释十倍的甲醛，边观察边显色，至条带清晰可见）7、停止：3.65gEDTA溶于250mL超纯水中，10min。8、水洗：用超纯水洗3次，每次5min。注：含甲醛的溶液要现配现用，因甲醛在空气中容易挥发而使浓度不足，使用时可按比例扩大，AgNO3溶液可重复使用，甲醛为还原剂，还原银离子为单质银。SDS-PAGE操作流程——碘染1、5%（W/V）BaCl2染胶板15min或更长时间。2、水洗三次，每次1min3、2.0gKI+1.3gI2+50mLH2O混匀，染胶15min。（先让KI溶于水，待完全溶解后加入I2）4、自来水洗至背景色消失，不要长时间水洗。