均相酶反应动力学

酶催化反应动力学基本要求：了解酶反应的特点，掌握M－M方程的推导、应用和各种抑制动力学的特征及其应用；熟悉复杂酶反应及其失活动力学的处理方法。M－M方程的推导、应用，各参数的意义及求取。重点和难点：第1章酶催化反应动力学1.1酶催化反应概论1.2简单的酶催化反应动力学1.3有抑制的酶催化反应动力学1.4复杂的酶催化反应动力学1.5反应条件对酶催化反应速率的影响1.6酶的界面催化反应动力学总结1.1酶催化反应概论国际生物化学协会IUB（InternationalUnionBiochemistry）按生化反应类型分为6类：氧化还原，转移，水解，裂合，异构，连接酶。酶：生物体内活细胞为其自身代谢活动而产生的具有催化活性的一类蛋白质。降低反应的活化能，加快生化反应的速率；但不改变反应的方向和平衡关系；不能改变反应的平衡常数，而只能加快反应达到平衡的速率。酶的催化共性反应前后状态不变：酶在反应过程中，其立体结构和离子价态可以发生某种变化，但在反应结束时，一般酶本身不消耗，并恢复到原来状态。酶的催化特性高效的催化活性高度的专一性酶反应需要辅因子的参与酶的催化活性可被调控酶易变性与失活高效的催化活性酶的分子活力：在最适宜的条件下，每1mol酶在单位时间内所能催化底物的最大量（mol）。酶催化中心活力：在单位时间内，每一个酶的催化中心所能催化底物的量（mol）。又称为酶的转换数。酶活力：在特定条件下，每1min能催化1umol底物转化为产物时所需要的酶量，称为一个酶单位，或称国际单位，用U表示。比活力：指每1mg酶所具有的酶单位数，用U/mg表示。也可以根据实际情况自定义。强的专一性专一性（选择性）：一种酶仅能作用于一种物质或一类结构相似的物质进行某一种反应的特性绝对专一性：脲酶相对专一性：脂肪酶反应专一性底物专一性立体专一性官能团专一性，序列专一性酶反应需要辅因子的参与⑵辅酶、辅基、辅底物⑴金属离子：金属酶（金属为辅基），与酶为可逆的结合Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Zn2+，Mn2+，Co2+，Fe3+，Mo6+等酶易变性与失活物理因素：热、压力、UV、X-ray、声波、振荡、冻结等化学因素：酸、碱、丙酮、乙醇、尿素、表面活性剂、重金属盐、氧化剂等。⑴热变性：Topt⑵酸碱变性：（pH）opt⑶氧化变性：巯基酶（SH酶）易在空气中氧化SH→S-S而失活酶反应的特性条件温和，能耗低反应专一，精制易，体系较纯易于控制，产物浓度高立体专一性利于不对称合成、制备自然界没有的新物质用组合酶、底物完成指定的多步合成转换反应优点缺点只能利用底物中部分组分，一般只能在水溶液中进行温和的反应条件也易于微生物繁殖易使酶染杂菌。失活后难以再生、复性只限一、二步反应，酶昂贵，较脆弱易变性，失活1.1.2酶的催化反应机制活性部位（活性中心）必需基团接触基团结合基团（结合中心）催化基团（催化中心）辅助基团1.1.2.2酶反应的专一性机制锁钥学说诱导契合学说过渡态学说1.1.2.3酶反应的高效性机制酸碱催化共价催化邻近及定向效应扭曲变形和构象变化效应多元催化与协同酶催化动力学的研究历史1897年，Buchner成功地用不含细胞的酵母液实现发酵，说明具有发酵作用的物质存在于细胞内，并不依赖活细胞。1902年，Henri提出酶与底物作用的中间复合物学说。1913年，Michaelis和Menten提出了酶催化反应动力学基本模型---米氏方程。1925年，Briggs和Haldane对米氏方程做了修正，提出稳态学说。1.2简单的酶催化反应动力学Michaelis与Menten发展出酶动力学MichaelisMentenNelson&Cox(2000)LehningerPrinciplesofBiochemistry(3e)p.258121():[]kkEkSPSEESEP1.2.1M-M方程的建立──“活性中间复合物”学说(1)反应机理ESppCkdtdnVr21(2-1)dtdnVrSS1121():[]kkEkSPSEESEP⑵快速“平衡”假设理论（L.Michaelis和M.L.Menten（1913））：(b)CS》CE(a)CEo=CE+C[ES](c)不考虑k-22[]kESEP(d)基元反应为控制步骤（Ks：解离常数）[][]11ESESESCCkCKskCCs(2-2)121[]kkkSEESEP而[]EOESECCC（2-3）[]EOSESCCCCsKs（2-4）,max2/()PPEOSSSrCsrkCCCKKsCs（2-5）由式（2-1）得M-Meq：sESsECCKC][⑶“拟稳态”假设（G.E.Briggs和J.B.SHaldane，1925）Cs》CE，中间复合物分解时所得到的酶又立即与底物相结合，从而使反应体系中复合物浓度维持不变。[]112[]0()ESESESdCkCCkkCdt（2-6）SESmSESECCKCCkkkC121SESmSESECCKCCkkkC121（2-7）（2-8）（2-10）（2-9）（2-9）（2-9）（2-9）（2-9）当k+2k-1时，Km=Ks。如果有一个酶有几种底物，则对每一种底物，各有一个特定的Km值。并且，Km值还受pH及温度的影响。Km值作为常数只是对一定的底物，一定的pH值，一定的温度条件而言，测定Km可以作为鉴别酶的手段。讨论：k-1和k+2表示的是中间复合物[ES]解离的速率常数；k+1则表示的是生成中间复合物[ES]的速率常数。因此，当Km值大时，表示复合物[ES]的结合力弱，易解离；当Km值小时，[ES]不易解离。12211()msKkkkKkk1.2.2动力学特征KmCsrsrmax1/2rmax当rp＝1/2rp,max时，Km＝Cs。Km：最重要的动力学常数，表达了反应性质，称为表观解离常数,max()pmpSSrcrKc（1）Cs《Km（2）Cs》Km为底物转化率式中：或：的初始积分得：结合可得：由米氏方程：ssssssmsstssmsstsmppsmsppXCCCXXKXCrCCKCCrCsCstCKrrCkCrr,11lnln)(,01111000000maxmaxmax,max,（3）Cs与Km相当1.2.3M-M方程参数的确定（1）Lineweaver-Burk法（简称L-B法）smpCrKrr111maxmax(2)Eadie-Hofstee法(简称E-H法)maxsmssrrrKCmaxsmsrCsKCr（3）Hanes-Woolf法（简称H-W法），又称Langmuir作图法（L-B基础上乘以Cs）maxmax111mssKrrrCmaxmaxssmsCCKrrr(4)Eisenthal和Cornish-Bowden直接线性作图将M-M方程取倒数，两边均乘以rmax：max1mssrKrC应用直线作图法求取动力学参数──微分法(a)L-B法；(b)H-W法；(C)E-H法(5)积分法微分法和积分法比较微分法中要引入反应速率为变量，但实验中不能直接测定反应速率，在Cs与t的关系曲线上求取相应各点的切线的斜率，才能确定不同时间的反应速率；积分法的主要问题是要保证随着反应的进行，反应产物的增加对反应速率不产生影响，否则不符合M-M方程成立的条件；现在可用非线性最小二乘法来回归处理实验数据，直接求取动力学参数。例1-1：有一均相酶催化反应，Km值为2×10-3mol/L，当底物的初始浓度Cs0为1×10-5mol/L时，若反应进行1min，则有2%的底物转化为产物。试求出:(1)当反应进行3min，底物转化为产物的百分数是多少？此时底物和产物的浓度分别是多少？(2)当Cs0为1×10-6mol/L时，也反应了3min，底物和产物的浓度又是多少？(3)最大反应速率rmax值为多少？解：（1）Cs0＝1×10-5mol/L0.01KmKttKrCCmssomaxlnt=1min时，Xs＝0.02Cs＝Cso（1-Xs）＝1×10-5（1-0.02）＝0.98×10-5mol/LK=0.0202min-1t=3min时，Cs＝0.94×10-5mol/L，Xs＝6％，Cp＝6×10-7mol/L（2）同理得t=3min时，Cs＝0.94×10-6mol/L，Xs＝6％，Cp＝6×10-8mol/L（3）rmax＝KKm＝0.0202×2×10-3＝4.04×10-5mol/（L·min）例1-2：室温下蔗糖在蔗糖酶的催化作用下水解得到产物蔗糖的初始浓度Cso＝1.0mmol/L，酶的初始浓度CEo＝0.01mmol/L，现有一间歇式操作的实验反应器测得了不同时间下蔗糖的浓度，根据实验提供的数据确定（1）该反应速率能否用M-M方程描述？（2）若可以，试求动力学参数Km和k+2的值。t/h/(/)ScmmolL00ln(/)/(/)SSSSCCCCLmmol0/[/(/)]SStCChmmolLt/h/(/)ScmmolL00ln(/)/(/)SSSSCCCCLmmol0/[/(/)]SStCChmmolL1234560.840.680.530.380.270.161.0901.2051.3511.5611.7942.1826.2506.2506.3836.4526.8497.14378910110.090.040.0180.0060.0052.6463.3534.0915.1476.0067.6928.3339.16510.06011.028例表2A时间与蔗糖浓度的关系1.3有抑制的酶反应动力学抑制剂（Inhibitor)：某些物质，它们并不引起酶蛋白变性，但能与酶分子上的某些必需基团（主要是指活性中心上的一些基团）发生化学反应，因而引起酶活力下降，甚至丧失，致使酶反应速率降低，能引起这种抑制作用的物质称为抑制剂。抑制作用：不可逆抑制：如果抑制剂与酶的基团成共价结合，则此时不能用物理方法去掉抑制剂。此类抑制可使酶永久性地失活。例如：重金属离子对木瓜蛋白酶的抑制作用。可逆抑制：可用诸如透析等物理方法把抑制剂去掉而恢复酶的活性，此时酶与抑制剂的结合存在着解离平衡的关系。类型：竞争性抑制，非竞争性抑制，反竞争性抑制，混合型抑制。1.3.1竞争性抑制酶催化反应动力学底物结构类似物，能在酶的活性部位上结合，从而阻止了酶与底物的结合，使酶催化底物的反应速率下降。特点：抑制剂与底物竞争酶的活性部位，当抑制剂与酶的活性部位结合之后，底物就不能再与酶结合，反之亦然。例：琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸为延胡索酸时，丙二酸是竞争性抑制剂12133[][]kkkkkESESEPEIEIIEI竞争性抑制的机理式为式中：—抑制剂—非活性复合物。][][0][33][][211][00)(EIESEEEIIEEIESSEESCCCCCkCCkdtdCCkkCCkdtdC又][2ESSICkrCsKCsrCsKCKCsrrmIIImSImaxmax)1(CsKCsrCsKCKCsrrKCKmCsCCCCKCCKmCCsCKmCCKCCKmkCCkCCsCKmCkCkkCCCCCCkCCkCkkCCkmIIImSIIIESSESIIESESESESIIESIEEIESSESEEIESEEEIIEESSEmaxmax][0][][][0442][33][432][1][21422442][][0432][33422][211)1()]1([::)(:00)(所以得