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产品信息和操作指南MouseIL-2预包被ELISAkitCat#:DKW12-2020-048/DKW12-2020-096本试剂盒专用于科研，而非用于诊断MouseIL-2DKW12-2020目录产品简介……………………………………………………………1知识背景……………………………………………………………1试剂盒提供的试剂…………………………………………………2需要实验者自行准备的试剂与仪器………………………………2注意事项……………………………………………………………3试剂的配制…………………………………………………………5操作过程……………………………………………………………7结果分析……………………………………………………………9试剂盒的保存………………………………………………………9操作步骤一览表……………………………………………………10参考文献……………………………………………………………11ELISA测定中可能会出现的问题及解决方法……………………12预包被ELISA试剂盒系列产品…………………………………15-1-1、产品简介：达优®小鼠IL-2ELISA试剂盒是通过酶联免疫吸附技术，定量检测细胞培养上清液和小鼠血清、血浆和其他体液中天然和重组IL-2的浓度。本试剂盒为预包被板，“夹心一步”完成，整个过程孵育时间不超过2.5小时，洗涤8次，操作时间大大减少。本试剂盒专用于科研，而非用于诊断。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂盒组分，若有任何疑问请与达科为生物工程有限公司联系，E-mail：RD@dakewe.com.检测范围：500-7.8pg/mL灵敏度：3pg/mL重复性：板内、板间变异系数均＜10％。2、知识背景：白细胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）主要由有丝分裂原或抗原活化的T淋巴细胞分泌，是一种多效细胞因子（1，2）。它在抗原特异的T细胞的克隆扩增中起着关键的作用。研究表明，它介导了多种细胞类型的多种免疫反应。-2-3、试剂盒提供的试剂：试剂规格配制Cytokinestandard2/1瓶*干粉状，按瓶上说明操作Biotinylatedantibody2/1瓶*1：100用DilutionbufferR（1×）稀释Streptavidin-HRP2/1瓶*1：100用DilutionbufferR（1×）稀释DilutionbufferR（1×）3/2瓶*即用型Washingbuffer（50×）1瓶150∶用蒸馏水稀释TMB1瓶即用型Stopsolution1瓶即用型PrecoatedELISAplate8×12或8×6*即用型封板膜2/1张*即用型说明书1份*：96/48Tests4、需要实验者自行准备的试剂与仪器：1．酶标仪（建议参考仪器使用说明提前预热）2．微量加液器及吸头：P10，P50，P100，P200，P10003．蒸馏水或去离子水4．全新滤纸5．旋涡振荡器和磁力搅拌器6．37℃温箱-3-5、注意事项：1.试剂应按瓶上标签说明储存，使用前室温平衡20-30分钟。实验前室温平衡对Washingbuffer（50×）、DilutionbufferR（1×）、PrecoatedELISAplate和TMB有重要意义。2.冻干标准品冰上操作，按照标签说明溶解干粉，充分混刀，按照一次使用量分装，-20℃贮存，避免反复冻融。3.预包被板条使用前，请恢复到室温后再打开外包装袋，实验中不用的板条立即放回包装中，密闭封口，4℃可保存1个月。其余不用试剂应包装好或盖好。4.Washingbuffer（50×）在4℃保存可能有结晶析出，使用前务必使结晶完全溶解后（如加热、平衡温度后混刀等）再配置成Washingbuffer（1×）工作液。5.HRP和检测抗体体积量很小，使用前请高速短暂离心管子，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。6.实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。7.使用前检查试剂盒内各种试剂；试剂稀释、加样和中止反应充分混刀或者摇刀对实验结果尤为重要，昀好使用低速频率振荡器或者反应过程中每15分钟手工摇刀一次。8.实验板孔加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应孔的孵育时间一致。9.使用洁净的塑料容器盛装洗涤液。-4-10.洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，滤纸上看不到水印。勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。11.TMB对光敏感，避免长时间暴露于光下，避免金属接触影响结果。有毒，避免用手接触！准备使用的TMB若变为蓝色，表明TMB已经污染，请丢弃。请在终止反应后10分钟内读取OD值。12.请严格按照说明书标明的时间和温度进行孵育。冬季室内温度偏低，请使用恒温箱或培养箱孵育为好。13.试剂盒在保质期内使用，且不同批号试剂不要混用。14.500pg/mL以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。大于500pg/mLIL-2的样品应以DilutionbufferR(1×)稀释后重做。在结果分析时，结合考虑相应的稀释度。15.特异性：不与小鼠其它细胞因子反应。-5-6、试剂的配制：1.提前20分钟将Washingbuffer(50×)和即用溶液从试剂盒中取出，以平衡至室温。2.Cytokinestandard：Standard为冻干粉。先按标签说明将冻干粉溶解，静置5-10分钟，再用DilutionbufferR（1×）稀释到推荐检测浓度。标准品溶解后混刀，准确倍比稀释，严格操作非常重要。标准品的倍比稀释昀好在进口的或者硅化的EP管中完成，减少非特异性吸附。在实验孔内进行倍比稀释时，注意操作规范，枪头勿刮划预包被的孔底。母液若没有用完请按照一次用量分装，-20℃保存。*推荐标准品浓度梯度为：500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.3pg/mL、15.6pg/mL、7.8pg/mL。3.Biotinylatedantibody：1100∶用DilutionbufferR(1×)稀释，混刀制成1×antibody工作液。4.Streptavidin-HRP：1100∶用DilutionbufferR(1×)稀释，混刀制成1×HRP工作液。-6-5.Washingbuffer(50×)：150∶用蒸馏水稀释。6.即用型溶液¾DilutionbufferR(1×):用于稀释Biotinylatedantibody、Streptavidin-HRP和Cytokinestandard。¾TMB¾Stopsolution-7-7、操作过程：1.使用前，将所有试剂充分混刀，避免产生泡沫。2.根据实验孔（空白和标准品）数量，确定所需的板条数目。样品（含标准品）和空白都应做复孔。3.加样：100μL/well加入稀释后的Cytokinestandard至标准品孔，100μL/well加入样品至样品孔，设置空白孔，用DilutionbufferR(1×)代替样本和标准品。4.加检测抗体：50μL/well加入稀释后的Biotinylatedantibody。混刀后，盖上封板膜，37℃温育90分钟。5.洗板：扣去孔内液体，300μL/well加入1×washingbuffer；停留1分钟后弃去孔内液体。重复4次，每一次在滤纸上扣干。6.加酶：100μL/well加入稀释后的Streptavidin-HRP。盖上封板膜，37℃温育30分钟。7.洗板：重复步骤5。8.显色：100μL/well加入TMB，37℃避光温育5-30分钟之间，根据孔内颜色的深浅（深蓝色）来判定终止反应。通常显色10-20分钟可以达到很好的效果。9.终止反应：100μL/well迅速加入Stopsolution终止反应。-8-10.读板：终止后10分钟内，用检测波长（measurementwavelength）450nm读值。推荐用双波长即检测波长（measurementwavelength）450nm、参考波长或校正波长（referencewavelength）610-630nm同时读板，测量结果会更准确。-9-8、结果分析：1.有两种设定空白对照的方案：1)将TMB空白显色孔设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去空白孔的吸光值后，在坐标纸上画出曲线，以吸光值作为纵坐标，以浓度作为横坐标。2)将零孔设为对照。得到的数据可以直接在坐标纸上画出曲线。2.根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算。若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。0.00.61.21.82.43.00200400600MouseIL-2Concentration（pg/mL）Absorption450nm9、试剂盒的保存：4ºC可稳定保存12个月。注意：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线来计算标本含量。-10-10、操作步骤一览表：加样品或配好的标准品，设置对照，100μL/well加生物素标记的抗体，50μL/well，混刀加亲和素-HRP标记物，100μL/well加TMB显色液，100μL/well加Stopsolution100μL/well，终止反应在λ＝450nm处读取吸光值37℃温育90分钟；洗4次37℃显色5-30分钟10分钟内读板37℃温育30分钟；洗4次无需温育，直接进行下一步操作-11-11、参考文献（1）Goldsmith,M.A.andW.C.Greene.(1994)inTheCytokineHandbook,2nded.,A.Thomsoneditor,AcademicPress,NewYork,p.57.（2）Hatakeyama,M.andT.Taniguchi.(1990)inPeptideGrowthFactorsandTheirReceptorsI,Sporn,M.B.andA.B.Robertseds.,Springer-Verlag,NewYork,p.523.（3）雷甜甜等.基础医学与临床,2009,29,618-621.（4）黄凯等.中国比较医学杂志,2009,19(11),31-35.（5）张榕等.中华微生物学和免疫学杂志,2007,27(3):285-287（6）邱惠等.中国免疫学杂志.2005,21:918-923.1212、ELISA测定中可能会出现的问题及解决方法问题可能的原因解决方法1．非常弱的结果（1）温育的时间或温度不够；（2）显色反应时间太短；（3）所用配制缓冲液的蒸馏水有问题；（4）加入抗体/酶的稀释液浓度太低；（5）酶标仪滤光片不正确；（6）不正确的试剂储存方式；（7）试剂盒没有充分平衡；（8）移液器吸液量不足，吸嘴内壁挂水太多或内壁不清洁。a.校正温育箱温度；b.校正定时钟准确定时；c.使用新鲜合格的蒸馏水；d.按照说明书保存试剂盒和准确配制工作液；e.试剂室温平衡至少20分钟，确保所有试剂已平衡至室温（约25℃）；f.校正移液器，吸嘴要配套，装吸嘴时要紧密，吸嘴内壁要清洁，昀好一次性使用。132．标准曲线和测定的重复性差这是典型的由测定操作引起的问题，包括（1）加样本及试剂量不准；孔间不一致；（2）加样过快，孔间发生污染；（3）加错样本；（4）加样本及试剂时，加在孔壁上部非包被区；（5）不同批号试剂盒中组分混用；（6）温育时间、洗板、显色时间不一致；（7）孔内污染杂物；（8）酶标仪滤光片不正确；（9）试剂/样品没有混刀；（10）血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性反应等。a.重复某一样品时，加样时间尽可能与第一次接近；b.重复测定标本，操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致，以排除这些因素造成的不一致的可能性；c.样品稀释前应充分混刀；d.尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴。3．白板（阳性对照不显色）（1）漏加酶结合物；（2）洗板液配制中出现问题，如量筒不干净，含酶抑制物（如叠氮钠）等；（3）添加的试剂错误或者被遗漏；（4）试剂过期；a.请按说明书所示稀释倍数配制；b.注意不要漏加；c.每次加液前均应核对