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手性分析工作总结2010.09.10朱万夏•一.手性现象的介绍•二.仪器手性拆分方式•三.液相手性柱分析方法开发流程•四.工作中的一些实例讨论一.手性现象的介绍•概念：问:什么是手性？答:分子组成与构造完全相同但分子的立体结构不同的化合物,他们不能完全叠合却互为镜像,(如左手与右手),这种特性就叫手性(chirality)。而这两个互为物体与镜像关系的立体异构体,称为对映异构体(enantiomers)。等量对映体的混合物，其旋光性相互抵消，没有旋光能力，称为外消旋体。CCCOOHOHHCH3HOOCHOCH3HCH3CHCOOHOH乳酸•手性分子的研究历史•1801年Hauy发现水晶晶体显示半面现象。•1809年Malus观察到水晶晶体引起的偏光效应。•1812年Biot发现了水晶片的旋光性•1815年Biot将研究延伸到有机物及其溶液，发现除石英外樟脑、柠檬油、松节油等酒精溶液以及蔗糖、酒石酸水溶液剂许多液体有机化合物具有旋光性。•1848年Pasteur在28岁时，研究酒石酸钠时发现有两种晶体。他在放大镜下根据晶形的不同用镊子将其分成两份，配制成溶液测旋光，发现一左旋、一右旋。又从结构上推想和分子结构的不对称联系起来，认为一物一像。（历史上第一个手性拆分实验）•1874年J.H.van’tHoff提出C四面体学说，记为：如果一个C上连有四个不同基因，在空间有两种排列，表示有二种不同的构型。二种构型之间为物象关系：外形相似，但不能重合。不对称C原子数目（n）与立体异构体数之间的关系为2n•1966年Lngold和V.Prelog分析讨论了旋光性与分子结构间的关系，建议将分子本身与其镜像不能重合的分子，定义为手性分子。如何判断：分子的手性与处于手性部分的一个或一个以上的特定原子有关，使分子具有手性的几何因素有手性中心、手性轴和手性面。手性中心：能引起分子具有手性的一个原子或者分子骨架的中心，最常见的是手性碳；值得注意的是：多价杂原子B,N,P,S等也可形成手性中心。手性轴：分子中若干原子组成轴状结构，因分子中的一些原子或基团在此轴周围的空间排列不同而产生手性。手性面：分子的手性由于某些基团对分子中的某一平面的不同分布而引起。CCCCabdc手性中心612345手性轴手性面螺几省CabcdNabcSbac•对映异构体特性:物理化学性质上：具备相同的熔沸点,溶解度，紫外，红外，核磁，质谱等,仅旋光方向相反。鉴别：XRD,XRPD生物活性上：可能有着巨大差异。OCH2CHCH2NHCH*OHCH3CH3Propranolol（萘心安）S-异构体为治疗心脏病药物心得安R-异构体为避孕药NNHOOOO**R-(+)-苎烯L-(-)-苎烯*~桔子味~柠檬味OOHHOH2NNH2S-天冬酰胺~甜的~苦的R-天冬酰胺NH2H2NOHOHOThalidomideR-异构体为镇静药（反应停）S-异构体有致畸胎作用对映体的不同生理活性20世纪90年代后，许多国家规定，凡结构中具有不对称因素的药物，即“手性药物”，必须拆分其相应的立体异构体，并分别研究其药理、毒理和药物代谢性质。对已上市的消旋体药物，要重新评价其光学异构体的性质。对新申报的药品，一开始就要合成其光学异构体。手性拆分在其他领域的应用：•农用化学•化妆品、香水、香料•营养品(人和动物)•光学材料（如光电子用手性液晶）二.仪器手性拆分方式常用的仪器分离手性化合物的技术•高效液相色谱(HPLC)•气相色谱(GC)(样品需具有一定的挥发性及热稳定性）•毛细管电泳(HPCE)•超临界流体色谱（SFC)•薄层色谱（TLC，定性）手性色谱柱的发展史1939年Henderson和Rule在乳糖上色谱分离外消旋樟脑衍生物1952年Dalgliesh：提出氨基酸在纸色谱上光学分离的三点作用假设1966年Gil-Au等：用GC直接分离对映体1971年Davankov和Rogozhin：引入手性配体交换色谱1972年Wulff和Sarhan：制备出手性LC的酶模拟聚合物1973年Hesse和Hagel：制备出手性拆分的纤维素三乙酸酯1973年Stewart和Dherty：把琼酯糖键合的牛血清清蛋白（BSA）用于手性拆分1974年Blaschke：由光学活性单体合成出用手性LC的手性聚合物1975年Gram等：用手性冠醚发展出主-客体色谱1979年Pirkle和House：合成出第一个硅胶键合手性固定相，并应用于手性LC分离1979年Okamoto等：合成出手性LC的螺旋形聚合物1982年Allenmark等：把琼酯键合的BSA用于手性LC1983年Hermansson：把硅胶键合的a1-酸糖蛋白用于手性拆分1984年Armstrong和DeMond：制备出硅胶键合环糊精固定相过去100年：拆分约7000种手性化合物手性色谱：已拆分近万种手性化合物液相色谱中的手性固定相已研制100多种HPLC分离方式：直接法（CMPA、CSP）：手性固定相法是由具有光学活性的单体，固定在硅胶或其它聚合物上制成手性固定相，通过引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异，从而达到光学异构体拆分的目的。手性流动相添加剂法：流动相中加入手性添加剂，在普通固定相上吸附，形成短暂的手性环境并对对映异构体间进行手性识别而达到分离。（环糊精，万古霉素，手性金属配合剂等）间接法（CDR）：手性试剂衍生法：流动相对映体混合物在预处理中进行柱前衍生组成一对非对映体(Diastereoisomers)，依其理化性质的差异，在非手性柱上得以分离。常用的衍生试剂：异硫氰酸脂类，酰氯类等三种方法比较优点缺点手性固定相法1.适用范围广2.分离制备简便3.定量分析可靠性高1.需特殊的固定相，价格昂贵2.少量样品依然需要柱前衍生（不一定是手性衍生化试剂）手性流动相添加剂法1.固定相简单2.非对映异构体化具可逆1.拆分化合物有限2.某些添加剂不够稳定手性试剂衍生法1.固定相流动相简单2.有利于增加紫外或荧光灵敏度1.高纯衍生化试剂2.异构体间衍生速率无法保证3.不可逆破坏手性色谱柱拆分机理1Dalgliesh:要实现手性识别，手性化合物分子与手性固定相之间至少存在三种相互作用。这种相互作用包括氢键、偶级-偶级作用、π-π作用、静电作用、疏水作用或空间作用,并且其中至少有一种作用具有立体选择性。Dalgliesh三点作用模型相互作用强，保留长，后出峰相互作用弱，保留短，先出峰基体(S)-选择子(R)-溶质②③①基体(S)-溶质(S)-选择子①②手性固定相法拆分机理2手性分离效果是多种相互作用共同作用的结果。这些相互作用通过影响包埋复合物的形成，特殊位点与分析物的键合等而改变手性分离结果。由于这种作用力较微弱，因此需要仔细调节、优化流动相和温度以达到最佳分离效果。手性固定相分类•刷（Brush）型或称为Prikle型•聚合物固定相（如纤维素、淀粉，合成的手性聚合物）•大环手性固定相（环糊精、手性冠醚、大环抗生素）•蛋白质（Protein）型•配体交换（Ligandexchange）型•分子印迹固定相CelluloseAmyloseDipole-dipolestackingHydrogenbondπ-πOOOOORRRRRRNHHHHHNNXYHydrogenbond聚合物固定相的手性化合物拆分作用力纤维素和直链淀粉的空间结构CelluloseAmylose（rigid&linear）（helical）OOOHOHHOnOOHOnOHOHOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO柱型号固定相，官能团拆分化合物类型ChiralpakODCellulose-1（phenomenex）纤维素三（3,5-二甲苯基氨基甲酸酯）含有芳香基、酰胺基、羰基、硝基、氨基、磺酰基、氰基、羧基、羟基等化合物的分离，及具有不对称点的位阻大的化合物的分离ChiralpakAS淀粉三[（S）-α-甲基苯基氨基甲酸酯]ChiralcelAD淀粉三（3,5-二甲苯基氨基甲酸酯）ChiralcelOJ纤维素三（4-甲基苯基甲酸酯）ChiralpakIA淀粉三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）ChiralpakIC纤维素三（3,5-二氯苯基氨基甲酸酯）市售常用的手性色谱柱：Daicel的“四大金刚”及新型的键合相系列，Phenomenex的Cellulose-1三.液相手性拆分方法流程液相手性方法开发的基本配置：液相部分：四元泵，DAD检测器手性色谱柱若干（150mm*4.6mm，5um）柱选择器（最好带温控）流动相:涂敷型：Hexane,Heptane,EtOH,IPA，ACN，MeOH（少量混合使用）添加剂：TFA，MSA，ESA(离子对),DEA，MEA，(HAC，HCOOH,丁胺)常备的配置的流动相（14种）：Hexane,Hexane(0.1%TFA),Hexane(0.1%DEA),Hexane(5%EtOH,0.1%MSA),Hexane(5%EtOH,0.1%MEA)EtOH,EtOH(0.1%TFA),EtOH(0.1%DEA)IPA,IPA(0.1%TFA),IPA(0.1%DEA),ACN，MEOH流动相：键合型（8种）THF，MtBE，CHCl3，CH2Cl2乙酸乙酯，1,4-二氧环乙烷，丙酮,甲苯（紫外吸收强）方法步骤：•了解待分离化合物样品结构信息•了解化合物反相色谱信息•样品前处理•选择合适的手性固定相（手性分析柱）•优化流动相，柱温•了解待分离化合物样品结构信息：手性方法建立的第一步为检查待测物的化学结构，尽可能地获取样品的如下信息——在不同溶剂中的溶解性。形成氢键、π键或者偶极相互作用的能力；是否有极性官能团（是否含氨基NH2-、羧基-COOH或者既含酸性基团又有碱性基团）；手性中心附近有无大的刚性取代基；紫外光谱可否检测，酸碱是否稳定等。诸如此类的样品结构信息对预判手性分离能力及手性固定相的选择有较大的帮助作用。•了解样品反相色谱信息：如果合成人员提供反相色谱信息，可以知道其样品的纯度。也可以根据流动相条件来确定手性分离中烷烃与醇的比例，甚至依此判定以及是否需要添加酸碱添加剂。•样品前处理：1.1~2mgEtOH，MeOH溶解。2.如难溶，且为盐，加入酸碱添加剂助溶。酸碱总浓度不要大于1%，且要有空白对照。3.也可以先以少量DMSO，DMF，CHCl2溶解，然后再用流动相稀释至不析出为止。4.如果样品紫外吸收很弱，则需加大样品浓度至10mg/ml.5.无紫外吸收，换检测器：ELSD或MS，或者让合成人员接生色基团。6.过滤进样。•选择合适的手性柱：从手性固定相对样品的通用性，适应范围考虑。如果是制备服务，在选择手性柱时还应考虑柱容量（柱样品荷载量）。各商品化的手性柱使用顺序大致为：IA（或AD-H）,IC，OD-H，AS-H，OJ-H•流动相条件优化以无水乙醇/正己烷为初始流动相，比例通过调整流动相中醇的含量或者改变醇的种类来增强对映体分离选择性。如果酸碱样品只有部分分离、没有分离或者峰形差、不出峰，可在流动相中添加有机酸、碱等改性剂来优化分离。涂敷型中性：Hexane：EtOH=70：30(V/V%)，流速：0.8ml/min酸性：含有-COOH，加入TFA碱性：含有-NH2，-NH-加入DEA，如峰形没有改善，可加入叔丁胺或者MEA酸碱基团都有：加入TFA，或者TFA与DEA混合的盐或MSA(0.1%)添加剂含量0.05%~0.3%。键合型：•柱温考察：常规温度加减10~15度1.常规条件：30度2.低温：15度3.高温：40度流动相的极性：常用溶剂极性表.xls流动相的互溶性：溶剂互溶表.pdf常用溶剂物性必备四.手性分离的特殊例子手性分离中的梯度模式min101520253035mAU02004006008001000VWD1A,Wavelength=220nm(201004\20100427\0000006.D)14.91916.19626.225Hexane：IPA=99：1(v/v%)NNONHOSiBoc改为梯度模式，220n