LCMSMS分析中如何获得准确的分析结果---复件

©2016WatersCorporation1LCMSMS分析中如何获得准确的分析结果田家良ApplicationSpecialist,EastChina,Waters2017.04©2016WatersCorporation2主要内容影响LC/MSMS分析结果的原因分析及解决方案如何快速建立LC/MSMS方法©2016WatersCorporation3样品UPLC-MS/MSUPLC-ToF检出前处理（SPE）残留快速筛查痕量准确定量分析残留分析一般流程检测结果确证©2016WatersCorporation4分析结果偏差的影响因素人员–相同人员随机误差，不同人员能力水平、操作习惯差异……仪器–仪器型号，类别，状态，更新程度影响检测结果；样品–不同样品，基质效应不同，增强或减弱；方法–样品处理方法，高回收率，低基质效应；–仪器方法，优化分离方法，检测器条件（如质谱检测器，MRM方法。。。）环境–环境不同，会影响相同方法得出的结果。©2016WatersCorporation5分析结果偏差原因分析人员–相同人员随机误差，不同人员能力水平、操作习惯差异……仪器–仪器型号，状态，先进程度影响检测结果；样品–基质效应，增强或减弱；方法–样品处理方法，高回收率，低基质效应；–仪器方法，优化分离方法，检测器条件（如质谱检测器，MRMR方法。。。）环境–环境不同，会影响相同方法得出的结果。©2016WatersCorporation6基质效应第一步第二步未经萃取的分析标准品萃取后加标的样品萃取后加标样品的响应值非萃取加标样品的响应值基质效应相同相同0%较低较高离子抑制%较高较低离子增强%©2016WatersCorporation7正确的计算回收率第一步第二步萃取后样品基质加标准品萃取后加标样品萃取后样品及标准品图正确测定回收率图计算回收率©2016WatersCorporation8•客户现场实验：•样品:客户提供了饲料基质加标溶液各一份（约1ml左右）和对应的基质空白溶液；•各个基质的提取液颜色较深，没有做净化步骤；•样品进完一针后，客户就把进样小瓶收回去了。•实验结果：•实际样品客户添加了100-200种真菌毒素、农药和兽药；•UNIFI处理结果中只确证了30多种，另有约30种不确定的结果，报告结果远远低于添加数。Q-TOF筛查多残留©2016WatersCorporation9•Checksystem（100多种兽药的混标，基本全部找到目标物，说明系统正常）Q-TOF筛查多残留©2016WatersCorporation10•客户有添加20多种磺胺类化合物，但实际样品中的筛查结果较差。Q-TOF筛查多残留©2016WatersCorporation11直接进样QuEChERS净化SPE净化稀释10倍Q-TOF筛查多残留©2016WatersCorporation12基质效应©2016WatersCorporation13•基质效应在电离源内产生的，与离子传输、质量分析和检测过程无关•能够引起基质效应的成分包括：无机盐，极性化合物（酚类，色素等），其他含氮有机化合物、离子对试剂以及与目标物结构类似的化合物等。•基质效应的机理：•瞬时共流出的组分之间基质效应产生的原因基质分析物©2016WatersCorporation14•基质效应在电离源内产生的，与离子传输、质量分析和检测过程无关•能够引起基质效应的成分包括：无机盐，极性化合物（酚类，色素等），其他含氮有机化合物、离子对试剂以及与目标物结构类似的化合物等。•基质效应的机理：•瞬时共流出的组分之间•离子化效率降低基质效应产生的原因©2016WatersCorporation15•基质效应在电离源内产生的，与离子传输、质量分析和检测过程无关•能够引起基质效应的成分包括：无机盐，极性化合物（酚类，色素等），其他含氮有机化合物、离子对试剂以及与目标物结构类似的化合物等。•基质效应的机理：•瞬时共流出的组分之间•离子化效率降低•目标物与干扰物竞争可用电荷（10-5mol/L)基质效应产生的原因©2016WatersCorporation16•基质效应在电离源内产生的，与离子传输、质量分析和检测过程无关•能够引起基质效应的成分包括：无机盐，极性化合物（酚类，色素等），其他含氮有机化合物、离子对试剂以及与目标物结构类似的化合物等。•基质效应的机理：•瞬时共流出的组分之间•离子从液相蒸发到气相的效率降低•目标物与干扰物竞争可用电荷（10-5mol/L)•目标物被中和，或与干扰物结合等原因基质效应产生的原因溶剂干扰物目标物稀释©2016WatersCorporation17Amethodformatrixeffectmonitoring基质效应在分析阶段的分布低极性干扰物基质效应强极性干扰物基质效应©2016WatersCorporation18脂类表面活性剂构成生物体内的膜结构，细胞膜的主要组成部分其他存在：卵磷脂–广泛存在于动植物体内，如：蛋黄，牛奶，大豆，动物组织细胞膜磷脂类介绍Phosphategroup“hydrophilichead”Fattyacids“hydrophobictails”©2016WatersCorporation19磷脂带来的基质效应——带来不可预测的结果蛋白沉淀法(PPT)处理样品,监测磷脂含量50针连续进样如图表明,磷脂会在柱子上累积,最终会损害色谱柱,导致柱寿命降低对于图中的两个化合物而言,后一个化合物由于更靠近磷脂的出峰区域,前后进样的重现性会受到严重影响.ApplicationNote:Rapid,ReliableMetaboliteRatioEvaluationforMISTAssessmentsinDrugDiscoveryandPreclinicalStudies,720004453enApplicationNote:Rapid,ReliableMetaboliteRatioEvaluationforMISTAssessmentsinDrugDiscoveryandPreclinicalStudies,720004453enDanaceauetal.2014Bioanalysis6(6)761-771©2016WatersCorporation20分析结果偏差原因分析——ISO/IEC17025:2005人员–相同人员随机误差，不同人员能力水平、操作习惯差异……仪器–不同厂家的仪器，–不同型号的仪器oWaters：Micro、Premier、AQUITYTQD、Xevofamily(TQD、TQ、TQ-S)…基质–matrixeffects，增强或减弱；方法–降低基质效应；–提高仪器方法开发的稳定可靠性环境–环境不同，会影响相同方法得出的结果。©2016WatersCorporation21•对于LCMSMS方法，净化是否不重要？•答案是否定的。•在目前的情况下，LCMSMS分析中常见的前处理方案：1.蛋白沉淀，Proteinprecipitation(PPT)2.液液萃取，Liquid-liquidextraction(LLE)3.“QuEChERS”前处理方法：应用最广，但仅适用于农药；4.固相萃取，Solid-phaseextraction(SPE)样品不做前处理，基质效应会严重影响仪器分析结果样品处理是去除基质效应的前提©2016WatersCorporation22UPLC分离效果是去除基质效应的关键环节UV检测MRM检测从数据记录方式看，每个化合物的MRM都有独立的数据通道，可分别提取，完全可以摒弃其他化合物，或基质的影响；而光谱检测则不然，因为所有信号相互叠加，组分之间必须完全分离∴对于LC-MRM分析，似乎LC的性能要求弱化了，可有可无了…实际情况如何？1.LC共流出的组分（不同的待检化合物、基质组分…）在离子化区会共同参与电荷的分配，从而产生信号干扰（抑制或增强）2.由于MS不喜欢非挥发性的盐存在，所以LC流动相的选择范围大大减小，所以就对LC系统本身（LC仪器和色谱柱）提出了更高的要求3.峰形的宽窄（窄而高，宽而矮），直接影响化合物的检出灵敏度LCMSMS技术中液相色谱的性能是去除基质效应的关键环节©2016WatersCorporation23洗脱条件的优化–等度洗脱，梯度洗脱？–如何设置梯度？建议的液相分离方法©2016WatersCorporation24串联四极杆分析沙丁胺醇基质背景信息实验中一开始检测不出样品中的化合物（如左图，标准品1.14min出峰），通过RADAR采集到的全扫描谱图（背景信息）发现，基质效应较大，可能存在基质抑制效应。经过调整液相分离梯度和条件，成功检测出目标峰（如右图）。此时RADAR采集到的全扫描谱图（背景信息）显示，大部分基质和目标物被分离开，减少了基质的影响，因而获得准确的检测结果。©2016WatersCorporation25如何获得获得更有信心的分析结果？-解决基质干扰问题©2016WatersCorporation26葡萄鳄梨墨角兰姜在痕量组分的背后还有什么?各种食品中10ppb农药残留（使用DisQuE处理）©2016WatersCorporation27获得更多丰富的样品信息同时获得MRM和全扫描数据的独特功能可获得单独运行MRM时无法得到的信息协助方法开发评估基质影响的风险鉴别样品背景是否有变化?©2016WatersCorporation28分析结果偏差原因分析——ISO/IEC17025:2005人员–相同人员随机误差，不同人员能力水平、操作习惯差异……仪器–不同厂家的仪器，–不同型号的仪器oWaters：Micro、Premier、AQUITYTQD、Xevofamily(TQD、TQ、TQ-S)…基质–matrixeffects，增强或减弱；方法–降低低基质效应；–仪器方法开发的稳定可靠性环境–环境不同，会影响相同方法得出的结果。©2016WatersCorporation29如何建立足够稳定、耐用、灵敏的LC-MSMS方法©2016WatersCorporation30LC方法的建立色谱柱的选择分离条件的选择流动相的种类，ACN还是MeOH？流动相中的添加剂的选择（以偏碱性化合物为例）对于MS分析：较容易结合质子，形成正离子，所以，一般正离子模式响应高些；正离子模式，化合物需要结合正离子，酸性添加剂对提高其MS正离子模式的灵敏度有利；对于反相LC分离：在碱性环境中，趋向于以分子形式存在，更易在反相色谱柱上保留，碱性添加剂，对其色谱分离是有利的∴应该平衡LC、MS两者的关系，以达到好的检出效果©2016WatersCorporation32MRM方法的建立MRM参数优化与确定–母离子、子离子质荷比的确定o跟已有的方法进行核对确认o用于建方法的标准品溶液，浓度不要太稀–相关电压参数的优化o锥孔电压o碰撞能量LC-MS联用参数的优化：离子源的雾化参数–喷雾电压–去溶剂气的流量–去溶剂气的温度–其他：反吹气的流量、离子源温度……色谱流动相的类型、流量1.自动输液流路控制2.自动MRM参数优化©2016WatersCorporation33IntelliStart：MRM方法建立完成报告1.用于建方法的标准品溶液，浓度不要太稀2.及时清洗管路©2016WatersCorporation34如何在定量同时进行定性？-解决假阳性问题©2016WatersCorporation35PICScanAcquisitionMRMAcquisitionXevo系列质谱特有的PICScan功能可以实现在MRM扫描通道的间隙对子离子作全扫描，得到各个被测物的所有子离子谱图，通过和标准谱图比对，极大地提高了实验结果的准确性。PICs—四极杆质谱子离子确认”防假阳”性功能©2016WatersCorporation36PICs在菠菜中多农残分析中的应用©2016WatersCorporation37阳性样品确证①保留