@PBMC分离及冻存流程

PBMC分离及冻存流程PBMC分离及冻存流程本实验采用密度梯度离心原理（Ficoll密度为1.077，PBMC平均密度为1.072），并通过反复离心洗涤，获得相对较纯的PBMC。1.试剂与耗材DPBS(PH=7.4,GIBCO,C14190)，RPMI1640(GIBCO,C22400)，FBS(GIBCO,10099)，Ficoll分离液（LymphoprepTM,1114740），台盼蓝（Sigma,117K2332），DMSO(Sigma,D5879-1l)，15ml和50mlFalcon离心管2.缓冲液配置P0：即不含FBS的PBSR0：即不含FBS的RPMI1640R10：即10%FBS的RPMI1640冻存液：即含10%DMSO的FBS所有液体配置后4°Ｃ保存，使用前30分钟平衡至室温。3.分离步骤（以每份血样25ml为例）1)在分离前30分钟，准备超净台，将缓冲液(P0,R10)和Ficoll分离液复温至室温；每个患者20ml的肝素钠抗凝血（绿色帽管），需要50ml离心管2个，15ml离心管3~4个2)登记样本基本信息，姓名，ID号，采血日期；3)650g离心7min，30ml血一共可留取3~4ml血浆（2mlep管圆底的3管）,以尽量不吸取到红细胞为原则，注意无菌操作，巴斯管不能伸进ep管。4)吸取的血浆离心3000rpm，10min，吸取上清。5)每位患者需要分装为4管血浆（1.5mlep管），血清视情况（10ml普通帽管）而定，1.5ml离心管每管1ml；5ml普通管中吸出300~400ul到1.5mlEP管中，标记后和HBVDNA申请单卷在一起，然后把5ml的普通管与雅培申请单卷在一起，送到血清室，反别放入相应的盒子中（盒子在台上或在透明玻璃门冰箱里），血清血浆放到小实验室卧室冰箱中。6)在50ml离心管中，加入PBS（2倍稀释），用巴斯管反复混匀剩下的血，倒入离心管中，反复混匀再转移至加入5mlFicoll分离液的15mlFalcon离心管3或4管（这样的分离效果会均匀一些，避免有一些管PBMC多一些）7)个别患者离心完第1步之后可能会呈现云雾状细胞团，吸取PBMC之后吹散即可，离心完第2步之后一定要彻底打散细胞。）8)将稀释的血液缓慢加入Ficoll分离液的表面（倾斜45度）；9)按程序1离心(800g，25分钟，室温，加速/减速设置为1)；PBMC分离及冻存流程10)轻柔的收集淋巴细胞带置于新的50mlFalcon离心管（1支），并加入PBS至50ml；尽量避免吸到分离液。11)按程序2离心(1800rpm，10分钟，室温，加速/减速设置为9)；12)弃去上清，轻弹管底打散细胞沉淀，并将细胞在4mlR10及16mlPBS中重新混悬；13)进行细胞计数(吸取20ul细胞悬液到计数板中，humanfreshPBMC，稀释20倍，校正)；等记，每5~8×106个细胞为一管14)按程序3进行离心(1500rpm，10分钟，室温，加速/减速设置为9)；15)弃去上清，轻弹管底打散细胞沉淀，按下一步实验要求用冻存液调整细胞浓度或冻存。4.冻存步骤1)预先配制相应体积的冻存液，置4℃冷却；2)在冻存管上标记样本姓名，冻存日期；3)接上述第15步，按6~8*106/ml密度计算冻存管数，按1ml/tube添加冻存液；4)将添加冻存液的细胞轻柔混匀后，1ml/tube分装至细胞冻存管；5)将冻存管置于细胞梯度冻存盒，后者置于-80℃冰箱（4号）；5.注意事项1)全过程无菌操作，动作轻柔细致；2)实验前必须将各种缓冲液和Ficoll平衡至室温，有必要可采用37°C水浴加热；3)第6步尽可能将所有PBMC吸取干净而少吸取Ficoll分离液；4)计数取样前务必充分混匀以确保计数准确；5)添加冻存液后细胞脆性增加，混匀时应该动作轻柔。6)冻存盒用了5次后应补充异丙醇。使用冻存盒务必先用吸水纸擦干孔的水，以免低温冻存后冻存管与冻存盒粘连，抹掉管上的字迹。使用后在冻存盒试用本登记。