第三蛋白质研究技术

第三章蛋白质的研究技术提纲一、蛋白质的理化性质（略讲）二、蛋白质的研究技术三、蛋白质的分类（不讲）提纲步骤三、转膜3膜的选择：NC，PVDF，尼龙膜转膜方法：半干转、湿转转膜确认原料是基础--膜选择种类NCPVDF尼龙膜选择标准a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；b.不影响后续的显色检测（也就是适合用于所选的显色方法，信噪比好）；c.后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜膜的选择转移方法半干转用滤纸吸buffer来做转移体系的转移方法；适合转移小分子量的蛋白；半干转的电流大小是按照面积来算的：1.2mA/cm2，时间是根据蛋白分子大小定的；56mA/膜1h湿转将膜、胶、滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的方法；适合转移大分子量（100KD以上）蛋白；湿转电流是恒定的，时间也是根据分子量而定；300mA1h封闭+阳极-阴极多孔垫片滤纸凝胶膜滤纸垫片2层滤纸膜（左上角标记）凝胶（Marker靠左）2层滤纸垫片白色夹板（正极）黑色夹板（负极）300mA1h56mA/膜1h转移操作转膜后确认丽春红：转膜后直接把纤维素膜浸到丽春红染色液里在摇床上摇,就能把蛋白质染成红色了,肉眼可见.丽春红带负电荷,可以与带正电荷的氨基酸残基结合,同时丽春红也可以与蛋白的非极性区相结合,从而形成红色的条带.1.可逆染色：丽春红对蛋白的染色是可逆的,染色后可以用蒸馏水,PBS或其它适当溶液洗去.2.与下游WB检测完全兼容，无任何干扰蛋白质预染Markers1.实时监测2.分子量参照封闭去除非特异结合位点：BlockingBuffer：3%BSA5%MilkRoomTemperature1h.•一抗的选择单克隆抗体多克隆抗体•二抗的选择HRP，AP，生物素，荧光素，罗丹明标记注意：抗体的稀释倍数是由底物和待检测蛋白质的丰度决定的，为了获得最佳实验结果，强烈推荐进行预实验，以确定具体的实验参数.抗体孵育抗体的选择作为western来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。用于western的抗体和用于ELISA的抗体，一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而可用于ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构象特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。HRP（辣根过氧化酶)AP（碱性磷酸酶）大小40kD140kD最佳酶活性PH：5－7PH：8－10酶活和二抗特异性好于AP抑制剂氰化物，硫化物叠氮钠氰化物，砷酸盐，有机磷，二价阳离子螯合剂稳定性零度以下稳定零度以下不稳定底物很多部分动力学特性快速慢价格便宜昂贵发光底物ECL显色底物TMB，CN，DABNBT，BCIP，NBT/BCIP两种常用检测酶系统的比较ECL：化学发光法检测方法化学显色法方便、便宜、有毒、灵敏度较低、费抗体、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测化学发光法灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、特异性高、可重新剥离检测八仙过海，各“显”神通--显色方法同位素法灵敏度高、不安全、环境污染、不方便和半衰期短荧光底物法Krypton™荧光底物SDS-PAGE电泳常见问题分析高背景条带弱其他推荐对照设置内参对照beta-actin(肌动蛋白)/beta-tubulin(微管蛋白)/GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)1.是检测整个WB实验过程及体系是否正常工作，如果一个实验连内参照都出不料阳性结果的话（在内参抗体有效的情况下），那么这个体系就是存在问题的了。2.半定量的标准：内参一般选择的管家基因编码表达的蛋白，在很多组织和细胞中中都是稳定表达的，因此可以作为检测靶蛋白表达量的标准。阳性对照检测一抗是否正常阴性对照检测一抗特异性空白对照不加一抗，只加二抗，检测二抗是否发生交叉反应PerfectDataSDS-PAGE转膜封闭一抗显色或化学发光二抗蛋白样品制备洗膜WesternBlotFurtherReadings生物秀WesternBlotting专题Millipore的蛋白印迹手册Bio-Rad的westernBlotting操作手册Westernblot问题解答专帖蛋白质的测序直接测定法①化学测定法②质谱间接测定法。˗先得到某一种蛋白质基因的核苷酸序列，然后根据通用的遗传密码表间接推导出由其决定的氨基酸序列。蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构直接测定法的主要步骤（一）、蛋白质测序策略(2)多肽链的拆分（一）、蛋白质测序策略几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体。可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。（一）、蛋白质测序策略(3)断开二硫键在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，防止重新被氧化。（一）、蛋白质测序策略(4)测定每条多肽链的AA组成，并计算出AA成分的分子比(5)分析多肽链的N-末端和C-末端(6)多肽链断裂成多个肽段采用两/多种不同的断裂方法将多肽断裂成两套或多套肽段，并将其分离。（一）、蛋白质测序策略(7)测定每个肽段的氨基酸顺序(8)确定肽段在多肽链中的次序利用两/多套肽段的AA顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的AA顺序。（一）、蛋白质测序策略(9)确定原多肽链中二硫键的位置。蛋白质顺序测定的基本战略将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序将肽段分离并测出顺序专一性裂解末端氨基酸测定二硫键拆开纯蛋白质胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链（最适pH约2，此时二硫键不断开）（在二硫键保持完整的条件下，将蛋白质特异切割成肽段。）经电泳分离各肽段用过甲酸断开二硫键，含有-S-S-的肽段带电性质发生变化，转向90℃二次电泳，曾含二硫键的肽段迁移率发生变化然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置二硫键位置的确定二硫键位置的确定对角线电泳Sanger反应1、末端分析二硝基氟苯（DNFB）法O2NFNO2+H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸末端氨基酸残基的鉴定N二硝基苯衍生物黄色二甲氨基萘磺酰-AA有强荧光，检测灵敏度高丹磺酰氯（DNS）法N(CH3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2HNCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸末端氨基酸残基的鉴定、末端分析1N(DNS-aa)苯异硫氰酸酯法（PITC法、Edman降解法）末端氨基酸残基的鉴定、末端分析1N—N=C=S+N—CH—COOHHHRPITC—N—C—N—CH—COOHHHRSPTC-氨基酸pH8.3苯异硫氰酸酯PITCPITCPTC-肽肽链外切酶从多肽链N-端逐个向里水解根据不同反应时间测出释放的AA种类和数量，按反应时间和AA残基释放量作动力学曲线④氨肽酶法（aminopeptidase,Apase）末端氨基酸残基的鉴定、末端分析1N末端氨基酸残基的鉴定肼，又称联氨，无色、油状液体，主要用作火箭和喷气发动机的燃料。多肽与无水肼加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成酰肼化物。酰肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。①肼解法（联氨法）、末端分析2C末端氨基酸残基的鉴定、末端分析2CC末端AA可用硼氢化锂还原成α氨基醇②硼氢化锂还原法HNCHCOOHRLiBH4HNCHCH2OHR水解混合氨基酸H2NCHCH2OHR+C端末端氨基酸残基的鉴定肽链外切酶:从多肽链C-端逐个水解根据不同反应时间释放出的AA种类和数量确定蛋白质C-末端残基顺序。③羧肽酶法、末端分析2C4种羧肽酶的来源和专一性羧肽酶来源专一性CpA胰脏能释放除pro、Arg和Lys以外的所有C端氨基酸CpB胰脏主要水解C端为Arg或Lys的肽键CpC植物或微生物相当广泛，几乎能释放C端的所有氨基酸CpY面包酵母可释放C端所有氨基酸1、酶解法:内切酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶外切酶：羧肽酶和氨肽酶多肽链的选择性降解多肽链的部分裂解R2=Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性强的AA水解速度较快NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链水解位点R2=Pro或Gly，不水解R1或R3=Pro，抑制水解嗜热菌蛋白酶（thermolysin)R1=Lys（K）和Arg（R）专一性较强，水解速度快R2=Pro（抑制）NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链水解位点胰蛋白酶trypsinR1=Phe（F）、Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AALeu、Met和His稍慢R2=Pro（抑制）pH8-9NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链水解位点糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）R1和/或R2＝Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）及其它疏水性AA水解速度较快R1=Pro（抑制）pH2NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽链水解位点胃蛋白酶Pepsin2、化学裂解法①溴化氰水解法——选择性地切割由Met羧基形成的肽键。甲硫氨酸（Methionine），又称蛋氨酸，对人而言是唯一的含硫必需氨基酸6、多肽链的部分裂解多肽链的选择性降解②羟胺（NH2OH）断裂：较专一性断裂Asn-Gly之间的肽键Asn-Leu及Asn-Ala键也能部分断裂肽段的分离纯化：凝胶过滤、凝胶电泳和HPLC法1、Edman法肽段氨基酸序列的测定（苯异硫氰酸酯法）Edman于1950年首先提出。2、氨肽酶法或羧肽酶法3、质谱法（MS）灵敏度高、所需样品少、测定速度快多肽序列分析实例