蒽酮法测定可溶性糖

Ⅰ蒽酮法测定可溶性糖一、原理糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为620nm，故在此波长下进行比色。二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料任何植物鲜样或干样。（二）试剂1.80％乙醇。2.葡萄糖标准溶液（100μg/mL）：准确称取100mg分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至100mL，使用时再稀释10倍（100μg/mL）。3．蒽酮试剂：称取1.0g蒽酮，溶于80%浓硫酸（将98%浓硫酸稀释，把浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中）1000mL中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用2～3周。（三）仪器设备分光光度计，分析天平，离心管，离心机，恒温水浴，试管，三角瓶，移液管（5、1、0.5mL），剪刀，瓷盘，玻棒，水浴锅，电炉，漏斗，滤纸。三、实验步骤1.样品中可溶性糖的提取称取剪碎混匀的新鲜样品0.5～1.0g（或干样粉末5～100mg），放入大试管中，加入15mL蒸馏水，在沸水浴中煮沸20min，取出冷却，过滤入100mL容量瓶中，用蒸馏水冲洗残渣数次，定容至刻度。2.标准曲线制作取6支大试管，从0～5分别编号，加入各试剂。蒽酮法测可溶性糖制作标准曲线的试剂量试剂管号012345100μg/mL葡萄糖溶液（mL）00.20.40.60.81.0蒸馏水（mL）1.00.80.60.40.20蒽酮试剂（mL）5.05.05.05.05.05.0葡萄糖量（μg）020406080100将各管快速摇动混匀后，在沸水浴中煮10min，取出冷却，在620nm波长下，用空白调零测定光密度，以光密度为纵坐标，含葡萄糖量（μg）为横坐标绘制标准曲线。3．样品测定取待测样品提取液1.0mL加蒽酮试剂5mL，同以上操作显色测定光密度。重复3次。四、结果计算溶性糖含量（％）＝从标准曲线查得糖的量（μg）×提取液体积（ml）×稀释倍数/[测定用样品液的体积(ml)×样品重量(g)×106]×100五、式中：C——从标准曲线查得葡萄糖量，μg。VT——样品提取液总体积,mL。V1——显色时取样品液量，mL。W——样品重（g）。