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天然药物化学实验指导1天然药物化学实验注意事项天然药物化学试验的特点是实验周期长,所用溶剂和试剂品种多,而且用量较大。许多有机溶剂具有易燃、有毒、腐蚀性,刺激性和爆炸性等特点。在实验操作过程中又经常需要加热或减压等操作,学生将接触各种热源和电器。如果操作不慎,易引起中毒、触电、烧伤、烫伤、火灾、爆炸等事故。所以要求每个实验操作者,必须加强爱护国家财产和保障人民生命安全的责任心,严格遵守操作规程,树立严密的科学实验态度,提高警惕,消除隐患,预防事故的发生。为了确保实验的安全进行,特作如下要求:一、实验前要必须充分预习实验内容,明确实验原理、操作步骤及注意事项。实验开始前应检查仪器是否完整无损,装置是否正确,经检查合格后方可开始实验。二、实验时要保持室内整齐、清洁、安静。不准做与实验无关的事情,不得擅自离开岗位。在实验过程中应密切观察实验进程是否正常,仪器又无漏气,破裂等现象。三、倒取和存放易燃性有机溶剂时,要远离火源。不得随意将易燃性、易爆性的有机溶剂及药品倒入水槽或污水缸内。不得在烤箱内烘烤留有易燃性有机溶剂的仪器或物品。四、使用精密仪器及电气设备时,应先了解其原理及操作规程,检查好电路,按操作规程进行。遇到不明了的问题应及时向老师请教,切忌自作主张,乱倒以仪器。电线及仪器不应放在潮湿处,不要用湿手接触电器。电器用完后,应立即清理,关好电源。五、回流或蒸馏易燃性有机溶剂时,应检查冷凝水是否畅通,仪器装置是否漏气。不得用明火直接加热,应根据其沸点选用水浴、油浴或砂浴。蒸馏溶剂时要加入沸石,否则将发生爆沸。添加溶剂时要移开水浴,待溶剂冷却后再加,并应重新加沸石。六、实验室中常用的苯、卤代苯、苯酚、苯胺、甲醇、二硫化碳、氰化物、汞和铅盐等化合物均为有毒或剧毒药品。人体中毒的途径一般为消化道、呼吸道或皮肤吸收。所以取用毒剧药时要注意切勿洒在容器外,不要接触皮肤或口腔。室内要通风良好,产生毒气的操作应在通风厨内进行。毒物及废液不得随意乱倒。实验室内严禁进食。七、实验结束时,应将水、电、门窗关妥后,方能离开实验室。八、实验时一旦不慎起火,应沉着冷静,积极灭火。首先立即切断实验室内所有电源及火天然药物化学实验指导2源,搬走易燃易爆物品,同时针对起火点情况,选用适当灭火器材进行灭火。九、急救常识。(一)外伤:及时取出伤口中的碎玻璃屑或固体物质,用蒸馏水冲洗后涂上红药水,用消毒纱布包扎。大伤口则先按紧主血管,急送医院治疗。(二)火伤:轻伤可在伤面涂以硼酸凡士林。重伤则须请医生诊治。(三)试剂灼伤:1.酸灼伤:立即用大量水冲洗,然后用3%碳酸氢钠溶液蘸洗。2.碱灼伤:立即用大量水冲洗,然后用1%醋酸溶液蘸洗。天然药物化学实验指导3实验一薄层板的制备、活度测定及薄层层析、纸层析的应用一、实验的目的要求：1.掌握TLC、PC的原理。2.掌握薄层层析板的制备及薄层层析、纸层析操作的基本方法。了解展开剂、吸附剂的选择以及与被分离物质的关系。3.应用薄层层析法、纸层析法检识中药草中的化学成分。二、层析分类与应用概述中草药的研究、鉴定工作中，对探讨中草药中含有哪些化学成分，如何将中草药中的有效成分提取、分离、精制，并鉴定结晶纯度等等。除常用的经典方法外，仍因中草药中化学成分复杂，许多成分结构类似，有效成分含量极少，仅仅采用经典方法往往难以达到分离的目的，所以必须配合各种近代的分离方法，其中常用分离效率高、操作较简便的层析分离法（Chromatography）。由于有效成分的类型不同、性质不同，因此选择层析法的种类也不同。可参阅教科书第二章第二节层析法的内容。本实验着重介绍薄层层析法（Thin-LayerChromatograp-hy,TLC）以及纸层析法(PaperChromatograp、PC)的应用。这些方法主要用于选择粗提取物的分离条件;化合物纯度的鉴定;制备一定量的某些化合物;或在薄层选用不同配比的混合溶剂。吸附层析主要考虑的是展开剂的极性;但被分离物质在展开剂中的溶解度也要影响到它的层析行为。在一种吸附上用多种展开剂试验后如果分离不成功,可改用另一种吸附剂来试验。分离的化合物在板上的比移值(Rf)在0.2-0.8之间为好。二组分之间Rf差值＞0.05,以免斑点重叠。(展开剂选用举例见教科书第19页表2-8)。在吸附层析中，吸附剂的活度，展开剂的极性，被分离物质的极性，是层析条件三要素，这三者的关系是相互联系的，见图。当A指向中极性物质时，则B就指向选用中等活度的吸附剂，C就指向选用中等极性的展开剂。如分别转到A＇B＇C＇的位置，则又是另一种情况。分配薄层层析—有些强极性化合物，能被吸附剂强烈吸附，用洗脱能力很强的溶剂仍很难推动。这时就必须选用分配层析。它是利用被分离物质在两相中（如水和非极性有机溶剂中）分配系数的不同而达到分离的目的。分配薄层层析常用的担体有硅胶、硅藻土、纤维素等。选择展开剂的根据是被分离的物质在展开剂（固定相、流动相）中的溶解度相差最大的天然药物化学实验指导4溶剂组成不同的比例，为首用试剂。化合物在流动相中的溶解度愈大，则它在分配层上移动得愈远，比移值就愈大。流动相应先用固定相饱和，固定相种类有水、不同PH的缓冲溶液、亲水有机相（甲酰胺、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇等）。流动相为含固定相（常用如水）的有机溶剂，有时为了防止弱酸、弱碱的解离，加入少量的酸和碱。薄层层析展开后的斑点检出，通常先在可见光下观察，划出有色物质的斑点位置，然后在紫外光分析灯下观察有无吸收或荧光斑点，并记录其颜色、位置及强弱，最后利用各化合物的特性反应，用喷雾器均匀地喷洒适当的显色剂，使层析谱显色。各类化合物所用的显色剂见附录4。络合薄层层析—在络合剂处理的吸附剂上进行吸附薄层层析行为时，不饱和化合物（络合物的供体）与络合剂（金属离子既络合物的受体）形成π络合物。在层析时可按照被分离的化合物不饱和度的位置、几何异构等情况，所形成络合物的络合强度不一，导致比值不同达到相互分离的目的。饱和脂肪酸不与受体络合，推向薄层的最前沿；含双键的比含三键的吸附牢；末端双键或环外双键比不是这种类型的吸附牢。由于硝酸银的存在影响一些显色剂的灵敏度，如碘蒸气很少用于该法的显色。有关络合层析各类化合物的溶剂系统及显色剂见附录4。三、一般操作技术（一）薄层层析薄层板的制备1.不加粘合剂的薄层板涂布法（1）氧化铝薄层将吸附剂置于薄层涂布器中，调节涂布器的高度，向前推动，即得均匀薄层。本实验主要用下述简易操作涂布薄层，取表面光滑，直径均一的玻璃棒一支，依据所制备薄层的宽度、厚度要求，在玻璃棒套上厚度为0.3-1mm的塑料圈或金属环，以使玻璃棒向前推动时能保持平行方向，操作时，将氧化铝粉均匀地铺在玻璃板上，按下图所示方式推动。Ag+CC2413天然药物化学实验指导5（2）纤维素薄层，一般取纤维素粉1份加水约5份，在研缸中混合均匀后，倒在玻璃板上，轻轻振动，使涂布均匀，水平放置，待水分蒸发至近干，于1002℃干燥30-60分钟即得。（3）聚酰胺薄层，取锦纶丝（无色干净废丝即可）用乙醇加热浸泡2-3次，除去蜡质等。称取洗净得锦纶丝1g，加85%甲酸5ml，在水浴上加热使溶，再加70%乙醇6ml，继续加热使完全溶解成透明胶状溶液。将此溶液适量倒在水平放置的、用清洁液洗净的玻璃片上，并自然向周围摊匀，厚度约为0.3mm，薄层太厚时，干后会裂开。将铺好的薄层水平放在盛温水的盘上，使盘中的水蒸气能熏湿薄层，盘子加玻璃板盖严密。薄层放置1小时完全固化变不透明白色，再放数小时后，再泡在流水中洗去甲酸，先在空气中晾干，后在烘箱中80℃恒温加热活化15分钟，冷后置干燥器中贮存备用。2.加粘合剂薄层的涂布法（1）硅胶G薄层，取硅胶G或硅胶GF1份，置研钵中加水约5份，研磨均匀，放置片刻，随即用药匙取一定量，分别倒在一定大小的玻璃片上（或倒入涂布器中，推动涂布）均匀涂布成0.25-0.5mm厚度，轻轻震动下玻璃板，使薄层面平整均匀，在水平位置放置，待薄层发白近干，于烘箱中110℃烘干活化1-2小时，冷后贮于干燥器中备用。活化烘干温度时间可依据需要调整。一般鉴识水溶性成分或一些极性大的成分时，所用薄层板只在空气中自然干燥，不经活化即可贮存备用。（2）硅胶（H）羧甲基纤维素（CMC—Na）薄层，取羧甲基纤维素0.2g，溶于25ml水中，在水浴上加热搅拌，使完全溶解，倒入研钵中加硅胶细粉（一般硅胶细粉过300目筛的，约6-8g，过200目筛的，约需10-20g，）研磨成稀糊，照硅胶G薄层涂布法制备薄层。或取2块2.5mm厚度的玻璃长板，中间夹一至几块2.2mm厚的薄层用玻璃片，将适量硅胶糊倒在中间，用药匙适当涂匀，另取一块边缘较平整的玻璃片将硅胶糊刮平，推出薄层板，水平放置，自然晾干后再活化贮存。氧化铝G薄层、氧化铝羧甲基纤维素钠薄层的制备方法同上，一般所需氧化铝量比硅胶稍多。硅胶烧结薄层采用硅胶细粉混合一定量的玻璃细粉，涂布在玻璃板上，在高温下将薄层烧结在玻璃板上，一般薄层厚度0.25mm，薄层用后经过处理，可以多次重复使用。3.特制薄层的制备根据分离工作的特殊需要，可制成以下几种特制薄层。（1）酸、碱薄层和PH缓冲薄层为了改变吸附剂的酸碱性，以改进分离效果，可在吸附剂中加入稀酸溶液（如0.1N-0.2N草酸溶液）代替水制成酸性氧化铝薄层使用。硅胶微呈酸性，可在铺层时用稀碱溶液（如0.1N-0.5N氢氧化钠溶液）代替水制成碱性的硅胶薄层。当用乙酸钠，磷酸盐等不同PH的缓冲薄层。天然药物化学实验指导6（2）络合薄层硝酸银薄层的制法，可在吸附剂中加入5-25%硝酸银水溶液代替水制成均匀糊状，在按常法铺成薄层。制成薄层避光阴干，于105℃活化半小时后避光贮存。制成的薄层以不变成灰色为好，可保存三天内应用。也可先把硝酸银用少量水溶解，再用甲醇稀释成10%溶液。把预先制好的硅胶G薄层浸入此溶液中约1分钟，取出避光阴干按上法活化、贮存。（二）点样将样品溶液滴到已制备好的薄层上，点的直径不大于2-3mm，样品滴加在距离薄层一端1-1.5cm的起始线上，点与点之间距离0.5-1cm，展开剂用量以浸没薄层起始线这边约为0.5cm的高度的量。一般定性时可用普通毛细管，定量可用微量注射器（1、10、50μl）。样品溶液应尽量选用易挥发的有机溶剂，以便点样后溶剂迅速挥发，以减少空气中水分对吸附剂活度的影响。如果样品为水溶液或不易挥发的溶剂，此时可用电吹风或红外灯加热，要注意遇热不要破坏化合物。点样量一般为几到几十微克。斑点要集中，所以点样时应点在原点上，直径要小。（三）展开剂选择的方法前面已提到选择展开剂的原则。在实际工作中大都还要经过实验而确定合适的展开剂。微量圆球技术（见柱层析）可对吸附薄层的展开剂进行初选。好的展开剂应要求是能把混合物的成分很好的分离。展开剂的质量对于展开结果的影响较大。溶剂要用三级（CP）或二级（AR）纯规则的溶剂。或将工业级的溶剂精制后应用。薄层的展开必须在一个密闭的层析缸中进行。层析缸内预先用展开剂蒸气饱和，饱和后才能进行展开。实际应用小层析缸时由于空间较小很快达到了饱和，同时展开时间短，对分离效果影响较小。边缘效应不明显。常用溶剂性质表（附录3）、共沸混合溶剂表（附录5）。供选择展开剂时参考。展开方式最常用的是上行法，它比下行法分离效果好，因展开剂移得较慢，除了单向展开外，由于单向展开第一次展开后几种成分分离得不太开，经过第二次转向展开后，就有可能分得更开些。对成分复杂和化学结构相近的混合物，常用这种双向展开法来分离。展开时一般在室温进行。当被分离物质见光易分解，则应用黑布（纸）罩上避光展开。展开完毕后，取出薄层板，用铅笔或小针划出展开剂的前沿位置，待展开剂挥散后进行斑点检出。天然药物化学实验指导7※羧甲基纤维素钠的溶液一般用0.5-1%浓度，宜预先配制后静置，取其上层澄清溶液应用，则所制备的薄层表面较为细腻平滑。鉴定未知成分时是用已知的标准品对照，书本上常见的Rf值都是多次实验的平均值，只有在基本相同的实验条件下进行层析，才能得到相近的Rf值。书本上的Rf值可以作为一系列化合物在薄层上的相应位置