5.1《DNA的粗提取与鉴定》教案

精品文档你我共享知识改变命运DNA的粗提取与鉴定【考试说明要求】1.制备和应用固定化酶（A）2.酵母细胞的固定化（B）【课堂活动】［基础回顾］一、实验原理1．DNA的溶解性DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度（如2mol/L）就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反(DNA在浓度为0.14mol/L的NaCl溶液中，溶解度最小)，以达到分离目的。此外，DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。2．DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60—80oC的高温，而DNA在80oC以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。3．DNA的鉴定在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。二、实验材料的选取凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大，如鸡血（原因：DNA含量丰富，材料易得，鸡血细胞吸水易胀破）。若用动物组织如猪肝，则需研磨。三、过程1．破碎细胞，获取含DNA的滤液动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。注意：①为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。②加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。③如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响?研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。④此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。2．去除滤液中的杂质方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。注意：①为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。②方案二与方案三的原理有什么不同？方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离（60～75℃的恒温水浴保温10～15min）。3．DNA的析出与鉴定精品文档你我共享知识改变命运将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液，静置2～3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。四、注意事项1．以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠防止血液凝固。2．加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。3．二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。4．DNA的溶解度与NaCl溶液浓度的关系：当NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，随浓度的升高，DNA的溶解度降低；当NaCl溶液浓度高于0.14mol/L时，随浓度升高，DNA的溶解度升高。5．盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器。鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于细胞内DNA的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就会更少。因此，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取过程的DNA的损失。［诊断检测］1.下列图示中能反映DNA溶解度与NaCl溶液浓度之间关系的是：2.在DNA粗提取的实验过程中，得到的丝状物主要成分就是DNA，依据是A．丝状物易溶于2mol／L的氯化钠溶液中B．丝状物溶解后，遇二苯胺(沸水浴)变蓝色C．丝状物能在约为O．14mol／L氯化钠溶液中析出D．加酒精可使溶解的丝状物再被析出3.在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，向5mL血细胞液中加入20mL蒸馏水的目的是A.使血细胞破裂B.防止血液凝固C.析出DNAD.使蛋白质与DNA分离4.在NaCl溶液中反复溶解、析出并过滤，就能除去DNA溶液中的杂质的理由不包括()A．用高浓度盐溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质B．用低浓度盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质C．反复操作就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质D．反复操作就能够使各种杂质变性而沉淀析出[典例引路]在采用鸡血为材料对DNA进行粗提取的实验中，如果需要进一步提取杂质较少的DNA，可以依据的原理是()A.在物质的量浓度为0.14mol/L的氯化钠溶液中DNA的溶解度最小B.DNA遇二苯胺在沸水浴的条件下会变成蓝色C.DNA不溶于酒精而细胞中的一些物质易溶于酒精D.质量浓度为0.1g/mL的柠檬酸钠溶液具有抗凝血作用有关DNA粗提取的操作，错误的是A．向溶解DNA的烧杯中加蒸馏水的目的是漂洗DNA精品文档你我共享知识改变命运B．DNA和杂质分子在95%的冷酒精中溶解度存在差异C．提取植物细胞DNA时需在研钵中加入洗涤剂和氯化钠等试剂D．提取动物细胞DNA时可用鸡血与蒸馏水混合后用玻璃棒搅拌[归纳总结]1.鸡血细胞的DNA提取5.评价：观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质6.酒精的使用①观察花生种子子叶细胞脂肪颗粒时，用体积分数为50％的酒精洗去浮色②叶绿体色素的提取和分离实验中，用无水酒精作有机溶剂提取色素2.实验关键(1)取材不用哺乳动物的血细胞(由于成熟红细胞无细胞核)。(2)获取DNA时要向鸡血细胞液加入足量的蒸馏水，以便使细胞膜和核膜破裂，把核内物质释放出来。(3)实验中的搅拌，除最后一次搅拌外，其余搅拌均要朝一个方向。并且，在析出DNA、DNA再溶解和提取中，各步骤搅拌都要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，防止DNA分子断裂。3.此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出，几次搅拌？答：整个实验共“两次蒸馏水，三次过滤，两次析出”①两次蒸馏水第一次：细胞吸水胀破第二次：使DNA黏稠物析出②三次过滤第一次：DNA存在于滤液里第二次：DNA被留在纱布上第三次：DNA存在于滤液里过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关，第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要使用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，使用的纱布为1－2层③两次析出第一次：用0.14mol／L的NaCl溶液,含杂质多第二次：用冷却的95％的酒精4.预冷的酒精溶液具有的优点①抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解。②降低分子运动易于形成沉淀析出。③低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。精品文档你我共享知识改变命运③制作洋葱根尖细胞装片时，用盐酸和酒精的混和液对根尖进行解离④DNA粗提取过程中，用体积分数为95％的冷却酒精可以进一步纯化DNA⑤70%的酒精用于消毒，如果酒的制作[变式训练]（多选）下列DNA粗提取的实验操作中，经离心或过滤后取上清液或滤液的有A．在新鲜鸡血中加入适量的柠檬酸钠，混合均匀后离心B．在盛有血细胞的塑料烧杯中加蒸馏水，快速搅拌后过滤C．在2mol／L的氯化钠溶液中放入丝状物，轻轻搅拌后过滤D．在溶有DNA的氯化钠溶液中缓缓加入蒸馏水，轻轻搅拌后过滤[当堂反馈]1.下列关于DNA粗提取与鉴定的说法中，正确的是A.析出DNA时要缓慢地加蒸馏水，当析出黏稠物时即不再加水B.在探究洗涤剂对植物细胞DNA提取的影响实验中，自变量是洗涤剂和食盐C.提取的DNA溶解后加入二苯胺试剂即可染成蓝色D.将含有DNA的滤液放在60℃～75℃的恒温水浴箱中保温后过滤，能去除蛋白质杂质2.（多）“DNA粗提取与鉴定”实验中，将含有一定杂质的DNA丝状物分别放入体积为2mL的四种溶液中，经搅拌后过滤，获得4种滤液，含DNA较少的是1蒸馏水中搅拌后过滤滤液E22mol／L的NaCl溶液搅拌后过滤滤液F3O．14mol／L的NaCl溶液中搅拌后过滤滤液G4冷却的95％的酒精溶液中搅拌后过滤滤液HA．滤液EB．滤液FC．滤液GD．滤液H3.在DNA的粗提取与鉴定试验中，有两次DNA的沉淀析出，其依据的原理是①DNA在NaCl的物质的量的浓度为O.14mol／L时，溶解度最低②DNA在冷却的体积分数为95％的酒精中能沉淀析出A．两次都是①B．两次都是②C．第一次是①，第二次是②D．第一次是②，第二次是①4.（多选）有关DNA粗提取的操作，正确的是A．盛放鸡血细胞液的容器最好是塑料容器B．将鸡血细胞液与蒸馏水混合，用玻璃棒沿一个方向快速搅拌，释放DNAC．向溶解DNA的烧杯中加蒸馏水的目的是漂洗DNAD．用漏斗和滤纸过滤析出的DNA，得到DNA粘稠物5.在《DNA粗提取》实验中，为得到含DNA的黏稠物，某同学进行了如下操作：①在新鲜鸡血中加入适量的柠檬酸钠，经离心后，除去血浆留下血细胞备用。②取5—10mL血细胞放入50mL的塑料烧杯中，并立即注入20mid．015mol／L的氯化钠溶液，快速搅拌5min后经滤纸过滤，取得其滤液。③滤液中加人40mL2mol／L的氯化钠溶液，并用玻璃棒一个方向快速搅拌lmin。④上述溶液中缓缓加人蒸馏水，同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌，同时加蒸馏水，直到溶液中出现丝状物为止，再进行过滤而得到含DNA的黏稠物。实验结果是：所得含DNA的黏稠物极少，导致下一步实验无法进行。请指出并改正该同学的实验操作上的三个错误：(3分)，，。(2)按正确操作提取和过滤黏稠物后，再溶解黏稠物所用的溶剂为(标明浓度)；提取含杂质较少的DNA的方法是。精品文档你我共享知识改变命运(3)鉴定DNA的试剂是试剂，DNA鉴定时对照实验的设置方法为。(2分)(4)采用牛或羊的血液做实验，取材方便，但即使正确操作也无法提取到DNA，而用动物的肝脏组织作为实验材料，实验结果良好，原因是，实验中最好增加一步骤为。（10分）（1）0.015mol/L的氯化钠溶液应改为蒸馏水；滤纸应改为纱布；直到溶液中出现丝状物为止应改为直到溶液中丝状物不再增加为止（每项1分）（2）2mol/L的NaCl溶液加入冷却的、体积分数为95%的酒精（3）二苯胺向试管中只加0.015mol/L的NaCl溶液和二苯胺试剂，不加DNA，沸水浴（4）哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核研磨①提取鸡血细胞的细胞核物质将制备好的鸡血细胞液5mL～10mL，注入到50mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20mL，同时用玻璃棒充分搅拌5min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。②溶解细胞核内的DNA将氯化钠的物质的量浓度为2mol/L40mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态③析出含DNA的粘稠物沿烧杯