质谱分析法

制作者:张中ExactiveLC/MSESQUIRE-HCTultrafleXtreme参考书目:1.谱学导论,范康年主编,高等教育出版社(2001).2.质谱解析,麦克拉弗蒂著,王光辉等译,化学工业出版社(1987).3.电喷雾质谱应用技术,帕拉马尼克等主编,蒋宏键等译,化学工业出版社(2005).4.有机质谱解析,王光辉等编著,化学工业出版社(2005).1.质谱分析方法简介2.常见质谱仪器的选择应用3.质谱分析过程与样品的制备4.质谱谱图解析及分析结果的表示一、质谱分析方法（MS）简介1.概述质谱法(MassSpectrometry,MS)是通过将样品转化为运动的气态离子并按质荷比(m/z)大小进行分离并记录其信息的分析方法。被分析的样品首先要离子化，然后利用不同离子在电场或磁场的运动行为的不同，把离子按质荷比（m/z）分开而得到质谱，通过样品的质谱和相关信息，可以得到样品的定性定量结果。离子源轰击样品带电荷的碎片离子电场加速(zeU)获得动能(1/2mV2)磁场分离(m/z)检测器记录离子的质量谱,以带电粒子即离子的质荷比为横坐标,以离子的相对丰度(相对强度）为纵坐标所构成的图谱。某一蛋白的质谱图2.发展简史•1910年：Thomson使用MS报道了Ne是由20Ne和22Ne两种同位素组成，同位素分析测定开始发展；•40年代：出现了第一台商品质谱仪，质谱进入了工农业生产领域，用于石油工业中烃的分析、人造橡胶生产过程控制；•50年代：质谱技术飞速发展，并广泛用于复杂有机混合物的结构分析，与NMR、IR等方法结合成为分子结构分析最有效的手段。•80年代：出现了一些新的质谱技术，如快原子轰击电离源，基质辅助激光解吸电离源，电喷雾电离源，大气压化学电离源，以及随之而来的比较成熟的液相色谱-质谱联用仪，感应耦合等离子体质谱仪，富立叶变换质谱仪等。这些新的电离技术和新的质谱仪使质谱分析又取得了长足进展。WolfgangPaulHansG.DehmeltJosephJ.ThomsonFrancisWilliamAston1906年诺贝尔物理奖1922年诺贝尔化学奖1989年诺贝尔物理奖离子阱技术用质谱发现同位素电荷在气体中运动2002年诺贝尔化学奖获得者日本科学家田中耕一(KoichiTanaka)1959年出生于日本富山县首府富山市，1983年获日本东北大学学士学位，现任职于京都市岛津制作所，为该公司研发工程师，分析测量事业部生命科学商务中心、生命科学研究所主任。他对化学的贡献类似于约翰·芬恩，因此也得到了1／4的奖金。美国科学家约翰·芬恩1917年出生于美国纽约市，1940年获耶鲁大学化学博士学位，1967年到1987年间任该大学教授，1987年起被聘为该大学名誉教授，自1994年起任弗吉尼亚联邦大学教授。他因为“发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法”和“发明了对生物大分子的质谱分析法”而获得今年诺贝尔化学奖1／4的奖金。3.质谱分析的内容（1）同位素质谱分析天然同位素发现和测定；同位素地质研究；研究有机反应机理及生物体；新陈代谢机理（2）无机质谱分析元素的定性、定量分析；ICP（电感应偶合等离子体）-MS联用可准确检测各种元素固体样品“立体”分析；表面、微区、逐层分析（3）有机质谱分析有机化合物结构和成分分析，为有机物结构分析的“四大谱”之一。提供有机化合物分子量及碎片离子的结构信息；高分辨率条件下，具有元素分析功能；与气相、液相色谱仪连用，使质谱成为天然产物、代谢产物、食品、药品分析的有效工具4.质谱仪的组成进样系统离子源真空系统质量分析器检测器数据处理系统离子源质量分析器（1）离子源离子源的作用是将欲分析样品电离，得到带有样品信息的离子。不同分子离子化所需要的能量差异很大，应选择不同的离解方法软电离方法能量的较低电离方法适用于易破裂或易电离样品硬电离方法能量较高的电离方法各种离子源的基本特征电子电离源(ElectronIonizationEI)电子电离源又称EI源，是应用最为广泛的离子源，它主要用于挥发性样品的电离。++++:R1:R2:R3:R4:e+注：谱图中可见分子离子，但碎片离子更常见M+e-(高速)→M+•+2e（低速）优点：(1)应用最广，标准质谱图基本都是采用EI源得到的；(2)质谱图再现性好，便于计算机检索及比较；(3)结构简单，操作方便。缺点：(1)质谱图中分子离子峰很弱或不出现（由于电子的能量高，分子离子进一步离解成碎片离子）;(2)样品必须易于气化,不适合极性大、热不稳定化合物。EI源：可变的离子化能量(10-240eV)对于易电离的物质降低电子能量，而对于难电离的物质则加大电子能量（常用70eV）。电子能量电子能量分子离子增加碎片离子增加电子能量↓电子能量↑产生的分子离子种类M+•或M-•化学电离源(ChemicalIonization,CI)化合物稳定性差，用EI方式不易得到分子离子,因而也就得不到分子量。为了得到分子量可以采用CI电离方式。用高能电子（100~240eV）轰击离子室内的反应气（甲烷；10~100Pa），电离产生CH5+和C2H5+，后者再与样品分子碰撞，产生准分子离子。++气体分子试样分子+准分子离子电子注：谱图中常见准分子离子优点：1）准分子离子峰强度高，便于推算分子量2）色质联用仪器，载气不必除去3）反映异构体的差别较EI谱要好些。缺点：碎片离子峰少，强度低。化学电离是通过离子-分子反应来完成的。反应气体一般是甲烷、异丁烷等。产生的分子离子或准分子离子种类不同类型的分子能被特定的正或负反应离子有选择地电离。例如，胺和醚等含杂原子的分子通常产生大量的[M+H]+,而饱和烃则常产生[M-H]+等。脯氨酸的EI和CI源的质谱图采用EI源时脯氨酸的分子离子峰(m/z=115)未出现,但碎片离子多，从中可获得许多有用的结构信息；采用CI源时准分子离子峰(M+1)很强，从而获得相对分子质量的信息。电喷雾电离源（ElectrosprayIonization，ESI）它的主要部件是一个多层套管组成的电喷雾喷咀。电场作用下使喷出的液体易分散成微滴。另外，在喷嘴的斜前方还有一个补助气喷咀，补助气的作用是使微滴的溶剂快速蒸发。在微滴蒸发过程中表面电荷密度逐渐增大，当增大到某个临界值时，离子就可以从表面蒸发出来。适合于分析不稳定的极性化合物和生物大分子注：质谱图中常见准分子离子形成带电小液滴溶剂蒸发和小液滴碎裂形成气相离子加到喷嘴上的电压可以是正，也可以是负。通过调节极性，可以得到正或负离子的质谱。软电离方式，分子量大，稳定性差的化合物，也不会在电离过程中发生分解，它用于分析极性强的大分子有机化合物，如蛋白质、肽、糖等。电喷雾电离源的最大特点是容易形成多电荷离子。这样，一个分子量为10000Da的分子若带有10个电荷，则其质荷比只有1000Da，进入了一般质谱仪可以分析的范围之内。根据这一特点，目前采用电喷雾电离，可以测量分子量在300000Da以上的蛋白质。产生的准分子离子种类低分子量化合物:正离子:(M+H)+(M+NH4)+(M+Na)+(M+K)+负离子:(M-H)-(M+Cl)-(M+Br)-(M+Ac)-生物大分子与聚合物：正负多电荷离子(M+nH)n+或(M-nH)n-正负簇合物离子的(nM+H)+或(nM-H)-大气压化学电离源(AtmosphericpressurechemicalIonization,APCI)结构与电喷雾源大致相同，不同之处在于APCI喷咀的下游放置一个针状放电电极，通过放电电极的高压放电，使空气中某些中性分子电离，产生H3O+，N2+，O2+和O+等离子，溶剂分子也会被电离，这些离子与分析物分子进行离子-分子反应，使分析物分子离子化，这些反应过程包括由质子转移和电荷交换产生正离子，质子脱离和电子捕获产生负离子等。适合于分析中性与极性较小的化合物,尤其是挥发性化合物注：质谱图中常见准分子离子产生的准分子离子种类正离子:(M+H)+(M+NH4)+(M+Na)+(M+K)+负离子:(M-H)-(M+Cl)-(M+Br)-(M+Ac)-离子种类更多基质辅助激光解吸源（Matrix-AssistedLaserDescriptionIonization，MALDI）激光解吸源是利用一定波长的脉冲式激光照射样品使样品电离的一种电离方式。被分析的样品置于涂有基质的样品靶上,激光照射到样品靶上,基质分子吸收激光能量，与样品分子一起蒸发到气相并使样品分子电离。可使热敏感或不挥发的化合物由固相直接得到离子。适合于分析生物大分子，分子量可达数十万至百万质量数。如肽、蛋白质、核酸等，需要选择合适的有机酸或甘油作为基质。注：质谱图中常见分子离子或准分子离子优点：可用于难于电离的样品，无明显的碎裂；允许样品中含非挥发性组分；特别适用于与飞行时间质谱相配（MALDI-TOFMS）。缺点：基质的选择烦琐；制样过程要求高。产生的分子离子或准分子离子种类(M+H)+或(M-H)-（类似于FAB法中由质子转移反应得到的离子）(M+Na)+，(M+K)+等（2）质量分析器将离子源中生成的各种离子按质荷比m／z分离。不同类型质谱仪区别主要在于此。质量分析器的主要类型有：磁分析器、飞行时间分析器、四极滤质器、离子捕获分析器、离子回旋共振分析器。四极滤质器(QuadrupoleMassFilter)通过加在四极杆上的交变电压，改变电压和频率进行扫描。从而允许一定质量的离子通过四极场到达接受器（是电场扫描）。m/z=2E/v2其中：E=电压（离子动能），v=离子速度优点扫描速度快，价格便宜，体积小，目前已开发出台式仪器被广泛使用。质量范围窄，分辨率有限（不能测定高分辨）缺点利用相同能量的带电离子，由于质量的差异而具有不同速度的原理，实现不同质量的离子以不同时间通过相同的漂移距离（领域）到达接受器。m/z=2E/v2,v=d/t代入左式得到m/z=Kt2(k=2E/d2)(d：飞行距离；t：飞行时间)飞行时间分析器（TimeOfFlight）m/z小的离子，漂移运动的速度快，最先通过漂移管，到达检测器。m/z大的离子，漂移运动的速度慢，最后通过漂移管，到达检测器。优点扫描速度快，灵敏度高，质量范围宽，结构简单，造价低廉等缺点分辨率低。但是，现在已经提高到10000以上分辨率离子阱质量分析器（IonTrapMassAnalyzer）通过电场或磁场将气相离子控制并贮存一段时间的装置。特定m/z离子在阱内一定轨道上稳定旋转，改变端电极电压，不同m/z离子飞出阱到达检测器；结构简单、成本低且易于操作，已用于GC－MS联用装置用于m/z200－2000的分子分析。静电轨道阱(OrbitrapMassAnalyzer)两个电极之间形成静电场。当高速运动带电离子进入Orbitrap内，在静电作用下围绕中心电极做圆周轨道运动，不同的离子在z方向形成不同频率ωz与（m/z）1/2成正比。检测器检测离子运动形成的电势，经过信号放大和快速傅立叶变换后形成频谱，经过处理最后形成质谱。5.质谱仪的性能指标（1）质量测定范围质谱仪所能够进行分析的样品的相对原子质量（或相对分子质量）范围，通常采用原子质量单位u(Da)度量。有机质谱仪一般可达几千。现代质谱仪甚至可以研究相对分子质量达几十万的生化样品。ESI-MS质谱的测定范围可达到3000,扩展模式下可达到6000.（2）分辨率指质谱仪分辨相邻质量数离子的能力。定义为：两个相等强度的相邻峰(质量分别为m1和m2)间的峰谷不大于峰高的10%时，则可认为两峰已分开，其分辨率R为：其中m1、m2为质量数(m1＜m2)1121mmRmmm==-D两峰质量数较小时，要求仪器分辨率越大。可见在质量数小时，分辨率亦较小。实际工作中，很难找到相邻的峰高相等、峰谷又为峰高的10％的两个峰。可任选一单峰，测其峰高50％处的峰宽FWHM当作Δm，此时R=m/Δm质谱仪的分辨本领与离子通道半径r、加速器和收集器狭缝宽度、离子源的性质和质量等因素有关。（3）灵敏度仪器对样品在量的方面的