乙型肝炎病毒检测技术的研究进展

乙型肝炎病毒检测技术的研究进展吴淑秋[关键词]乙型肝炎病毒检测技术乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)感染是世界范围内严重的公共卫生问题之一,约5%的世界人口现行慢性感染，在我国乙型肝炎是常见的传染病和多发病之一，主要通过血液、血制品、性传播及母婴传播，是引起肝硬化和肝癌的常见病因。我国一般人群中HBsAg阳性率约为10％左右，乙型肝炎其传染性和病死率均居高不下[1]，已经成为现在最为严重的社会公共卫生问题，严重影响着人们的身体健康。所以乙型肝炎病毒的早期、准确、定量检测对乙型肝炎临床诊断、疗效观察及预防具有重要的意义。随着检测技术的不断发展，对乙型肝炎血清标记物的认识也在不断深入和更新。到目前为止,乙型肝炎病毒病原学检测主要是电子显微镜技术、免疫学技术和分子生物学技术和基因芯片技术,现将乙型肝炎病毒几种检测技术作一综述。1电子显微镜技术电子显微镜技术主要包括常规电镜法(electronmicros-copy,EM)和免疫电镜法(immuneelectronmicroscopy,IEM)。1.1常规电镜法1970年英国学者Dane等在电镜下发现了完整HBV颗粒即Danes颗粒[2],RDeVos等随后用电子显微镜观察18例HBsAg阳性的慢性肝炎患者的肝组织,发现了直径约25nm的核心抗原(HBcAg)颗粒[3]。常规电镜法的优点是标本用量小、制样速度快、观察比较直观,不过因其观察灵敏度较低而要求病毒在标本中大量存在,所以本检测技术在观察HBV方面的应用受到限制。1.2免疫电镜法免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物,是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学。Takashi等[4]对96例HBsAg阳性患者的肝组织进行免疫电镜观察,发现在肝细胞胞浆和胞核中存在HBcAg和HBeAg。胡莲美等[5]在HBV转基因小鼠血清中发现直径约22nm的球形HBsAg,以及少量直径约42nm的Danes颗粒。免疫电镜法较常规电镜法的敏感性高,从而可增加HBV的检出率,但该检测技术的样本制备过程较复杂,对操作者的技能要求较高。2免疫学技术1.1酶联免疫吸附法(ELISA)ELISA法利用酶催化底物反应的放大作用，是一种固相酶免疫检测技术，因其实用性、简便性和经济性，此法敏感性可达0.7ng/ml[6]，是检测乙型肝炎病毒血清标志物的首选方法[7]，被广泛用于临床及输血员的HBV筛查工作中，与放射免疫技术相比较最大的优势在于该法避免了对环境和人体的危害，并且试剂有效期较长。但是其影响因素较多[8]，操作中的各个环节对检测结果影响均较大，如试剂的不均一性、血清不稀释产生的非特异性反应及检验人员的熟练程度等均可影响ELISA检测结果的准确性，特别是一些低浓度的标本，在临床检验中除正常反应外，有时常可见到一些错误的结果（即假阳性或者假阴性结果）。李伟等[9]报道ELISA检测HBsAg为阴性的血液用聚合酶链反应（PCR）可检出HBV-DNA，体内仍有HBV复制。而蔺承艳等[10]发现，当HBsAb浓度为10mIU/mL时，ELISA检测为弱阳性，5mIU/mL及其以下均为阴性。1.2微粒子酶免疫分析(MEIA)MEIA检测HBsAg是目前世界上检测乙型肝炎病毒标志物的金标准[11]，采用顺磁性微粒作为固相载体，用稳定的4-甲基磷酸伞型酮(MUP)测出荧光发光的强度来检测被测物的浓度，对HBsAg检测的灵敏度达0.17~0.2ng/ml。它不但灵敏度高且抗干扰能力强，重复性好，并可单份检测，可检出人群中低浓度和自然感染获得的乙型肝炎病毒核心抗体[12]。彭仕芳等[13]对1140例乙型肝炎患者血清HBV标志物用MEIA和ELISA两种方法检测HBsAg、HBeAg、抗-HBc和抗-HBe四项指标,结果显示MEIA法检测的阳性率分别为94.00%、46.75%、97.96%和61.41%,而ELISA法检测的阳性率分别为91.89%、36.14%、93.26%和18.11%,即MEIA法检测各指标的阳性率均高于ELISA法,其中两种方法检测的HBeAg和抗-HBe的阳性率差异有高度显著性(P0.01)。与MEIA法比较,ELISA法检HBsAg的相对灵敏度为97.46%,抗-HBc为94.93%,HBeAg为73.41%,抗-HBe为41.73%。廖美英[14]对130例患者进行乙型肝炎病毒血清标志物检测，分别采用MEIA检测方法和ELISA检测方法，结果MEIA和ELISA在检测HBsAg、HBeAg和抗-HBs中，结果基本相符，符合率为96％以上。但是，抗-HBe和抗-HBc的检测结果相符率分别为90.00％和86.15％，因此认为MEIA法对血清HBV标志物的检出阳性率高于ELISA法,且MEIA比ELISA自动化程度高，对病情可做动态监测。1.3固相放射免疫法(SPRIA)SPRIA法是利用放射性同位素标记已知的抗原或抗体,使其与待测的相应抗体或抗原结合,洗去未结合部分,最后用γ计数器测定放射性强度,从而推算出受检的抗原或抗体含量。SPRIA灵敏度高,检测生物活性物质可达Pg水平,比ELISA的灵敏度高20倍[9]。徐群清等对886名在校大学生进行乙型肝炎病毒血清标志物检测,结果SPRIA显示检出HBsAg阳性96例,ELISA法检出93例;SPRIA法检测HB-sAg的敏感性、准确性和阳性符合率分别为96%、99.4%和98.9%,而ELISA法检测HBsAg的敏感性、准确性和阳性符合率分别为87.7%、98.1%和95.8%,因此认为用SPRIA定量测定乙型肝炎病毒标志物可提高检出HBsAg的灵敏度[15]。但邓春艳等[16]认为SPRIA对乙型肝炎病毒感染的诊断和疗效观察以及指导乙肝疫苗的接种更有临床的意义。1.4时间分辨荧光免疫法（TRFIA）时间分辨荧光分析(TRFIA)法是近年来应用于临床的一种非放射免疫学检测技术[17]，利用稀土离子螯合物作为标记物，并采用独特的荧光解离—增强技术，通过时间延迟去除非特异性荧光，在固定时间检测特异性荧光，属于全自动检测技术，避免了人为因素引起的加样误差，是解决因钩状效应而导致漏检的最可靠方法，可以用于乙型肝炎病毒标志物的定量检测。TRFIA[18]检测HBsAb灵敏度可达5mIU/mL以下，因此对于HBsAb定量检测更敏感，并能正确评价抗体是否具有“中和”HBV的能力，对于病情动态观察及其转归的分析有着较高的临床价值[19]。且TRFIA具有重复性好、标记物稳定定量范围宽、无放射物质危害等优点，采用振荡反应适当延长反应时间，更有助于提高灵敏度，但是检测过程耗时较长，不能用于快速检验，且费用较高[20]。1.5电化学发光免疫法（ECLIA）电化学学发免疫检测在原理上与化学发光检测法基本相同，只是将探针固定在电极上，将化学信号转化成电信号后检测，在HBV-DNA分析时，通常是将HBV-DNA探针通过自组装单分子层（SAM）或亲和素的方法固定在生物传感器上，用补偿DNA与之杂交，并选用适当的指示剂检测杂交反应程度。杨清娟等[21]报道了一种用戊二醛将氨基修饰的寡核酸探针固定于氨基磁珠表面制成核酸传感器，用α-萘酚磷酸酯做杂交的指示剂，采用差示脉冲伏安法测定杂交的结果，成功检测了乙型肝炎病毒HBV-DNA的片断。张国元等[22]发现，ECLIA检测下限达到1pmol/L，即使ELISA检测为弱阳性，甚至漏检，ECLIA仍能检测到。1.6胶体金免疫层析实验（GICA）其以胶体金作为标志物，利用层析作用来检测抗原或抗体。与ELISA检测表面抗体相比，胶体金层析试纸条可测末梢全血和血清，即时采即时测，操作简单，可最大限度地避免检测过程中各种因素对结果的影响。检测HBsAg具有简便快速、不需要仪器设备等优点，但灵敏度较低，对部分弱阳性标本易漏检。GICA适用于大规模人群普查HBsAg的感染，以及临床急诊标本和义务献血现场筛查等快速检测。李岩等[23]对1024份健康体检血清标本同时用GICA和ELISA检测HBsAg，结果表明两者的灵敏度有差异，GICA法的灵敏度稍低于ELISA法。杨侠宇[24]分析GICA法造成漏诊的原因主要是：该检测技术本身的灵敏度差，其最低检测限为1ng/ml；检测人员操作不熟练，观察时间短，观察经验不足；金标纸受潮等等。王荣香等[25]认为，GICA法在门诊患者创伤性操作前检测对减少和杜绝医源性经血液传播疾病，保护医患双方的利益，预防院内感染有着重要意义。3分子生物学方法3.1核酸探针法核酸的分子杂交基于其组成的碱基可通过配对互补结合,带有标记物的DNA或RNA片段能与互补的核酸序列特异结合,这种片段称为核酸探针。核酸探针的标记可用核素P32、S35、I131等,以及非放射性物质如生物素、地高辛等。HBV的核酸探针有DNA探针和RNA探针两种。核酸探针法的主要特点是敏感性、特异性都较强。3.2PCR法PCR方法由Saiki首先提出,由于此检测技术比核酸探针法的敏感性和特异性更强,因此自20世纪90年代初以来在我国得到广泛推广应用。PCR法主要分为定性PCR和定量PCR。3.2.1巢式聚合酶链式反应(nestedPCR,nPCR)nPCR是用两对引物先后扩增同一样品,即先用第一对引物扩增一段较长的靶基因,然后以第一次的扩增产物为模板,再用第二对引物扩增其中的部分片断。这种方法不仅比常规的PCR灵敏度大大提高,而且由于有第二次扩增,提高了特异性。nPCR为定性检测方法,不能直接定量,其产物需要通过凝胶电泳来定性判断[26]。Giovanni等应用nPCR方法对98位志愿者(其中16人HbcAb阳性,其余82人乙型肝炎病毒血清标志全部为阴性)的肝组织进行检测,发现16人(16.3%)为隐匿性乙型肝炎病毒感染,其中10人(10/16,62.5%)是血清HBcAg阳性,6/16血清标志物阴性(7.3%)病人均阴性抗体丙型肝炎病毒,说明提示nPCR灵敏度高[27]。3.2.2多重PCR(multiplexPCR,mPCR)mPCR又称多重引物PCR或复合PCR,是在同一PCR体系中加入两对以上的引物以同时扩增出多个核酸片断。mPCR反应试剂和操作过程与一般PCR相同,具有高效性、系统性和经济简便等特点。mPCR产物也需要通过进行凝胶电泳来定性判断。郭皓宇等[28]利用mPCR法对30例慢性乙肝患者的外周血单个核细胞(PBMC)进行检测,发现23例HBVDNA与HBVcccD-NA阳性,因此认为mPCR法节省时间和试剂,能为临床提供更多更准确的诊断信息。mPCR法适用于对样本进行快速检测,特别是对于混合病毒感染的样本。3.2.3竞争性PCR(competitivePCR,cPCR)cPCR是将靶基因与参考模板在同一反应管中共同扩增,其中的参考模板通常是靶DNA序列经插入或缺失一段核苷酸构成的突变体序列,与待测靶序列具有相同的引物结合位点,能与靶测序列竞争聚合酶、核苷酸和引物分子。cPCR操作中将参考模板作系列稀释以后,加入恒量的待测靶序列进行PCR扩增,然后进行电泳分离,产物在电泳凝胶上的荧光强度通过扫描定量,再通过已知的参考模板量推算出样本的初始浓度。cPCR的优点是能有效地控制不同反应管间扩增效率的差异,并且靶基因浓度的适应范围较大,但该方法在整个操作过程中需进行凝胶电泳、Southernblot以及32P标记的同位素探针来进行定量分析[28]。3.2.4实时荧光定量PCR(real-timePCR或fluorescencequantitativePCR,FQ-PCR)FQ-PCR是一种实时定量检测技术,融汇了PCR的灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术的精确定量等优点。基本原理是利用TaqDNA聚合酶的5'-3'外切核酸酶活性,在扩增的同时降解杂交于扩增区域内的探针,使连接于杂交探针的荧光淬灭基团和荧光发射基团分离而产生荧光,因此荧光强度的变化能反映扩增产物量的变化。所谓实时即是指在扩增的每一个循环中均由计算机同步跟踪和直接探测扩增过程