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1VFA分析操作规程------比色法VFA是厌氧发酵中微生物代谢的重要中间产物，甲烷菌利用VFA形成甲烷，属于产甲烷的原料，但厌氧反应器中过多积累VFA抑制甲烷菌的活性，测定VFA含量作为分析厌氧发酵好坏的重要指标一.实验原理含挥发性脂肪酸的样液，在加热的条件下，与酸性乙二醇作用生成酯，此酯与羧胺反应，形成氧肟酸。在高铁试剂存在下，氧肟酸转化为高铁氧肟酸的棕红色络合物，其颜色的深浅在一个较大的范围内与反应初始物——挥发性脂肪酸的含量成正比，故可用比色法测定。二.试验药品1.1：1硫酸浓硫酸（相对密度1.84，C.P.）加到同体积蒸馏水中稀释配制。2.4.5mol/L的氢氧化钠称取180g氢氧化钠(C.P.)溶于水中，冷后以蒸馏水稀释至1L3.10%硫酸羟胺溶液称取硫酸羟胺(C.P.)10.0g，溶于100mL蒸馏水中。4.酸性氯化铁试剂将20.0g分析纯FeCl3·6H2O溶于500mL水中，准确加入20.0mL浓硫酸并以蒸馏水稀释至1L。5.乙二醇分析纯乙二醇三.试验仪器及设备800B型离心机25ml比色管电炉2752紫外分光光度计PH计容量瓶、移液管、烧杯四、测定步骤1、采样测定脂肪酸的样品应特别注意样品的代表性，采集的样品应尽快分析测定，如需放置，应密闭储存在4℃冷藏冰箱中，保存时间不能超过24h。2、步骤2.1乙酸标准液的配制及标准曲线的绘制2.1.1精确称取乙酸（分析纯，相对密度1.045，含量99.0%）1.010g，以蒸馏水稀释至100mL，此溶液含乙酸10mg/mL。2.1.2准确吸取10mg/mL乙酸标准溶液1.0mL、5.0mL、10.0mL、15.0mL、20.0mL、25.0mL、30.0mL，分别置于100.0mL容量瓶内，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得100mg/L、500mg/L、1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L、2500mg/L、3000mg/L的乙酸标准系列液。2.1.3分别吸取0.5mL乙酸标准溶液分置于比色管中（12.5cm×1.5cm），同时吸取0.5ml蒸馏水作空白管，每管中准确加入1.5mL乙二醇和0.2mL稀硫酸，于沸水浴中加热3min，然后立即以冷水冷却；再加入0.5mL硫酸羟胺和2.0mL4.5mol/L的氢氧化钠，充分摇匀，放置1min，然后滴入10mL酸性氯化铁，用蒸馏水定容至25ml，并充分摇匀，静置5min，用分光光度计以500nm波长测定光密度，以纵坐标表示浓度值，横坐标表示光密度值绘制标准曲线。2.2样品的测定2.2.1样品预处理：样品先经果汁机打匀2.2.2取打匀样品于离心管中（2-6个），用800B型离心机离心约15min，倒出上清液并混合均匀。2.2.3依椐脂肪酸含量的高低决定稀释倍数。准确量取25ml上清液于250ml或500ml容量瓶中，并用蒸馏水稀释至刻度，混匀，将水样倒入烧杯中。2.2.4取稀释的待测水样0.5ml，按标准曲线做法2.1.3进行操作，一式两份并同时做空白试验一份。32.2.5计算两份光密度平均值，查标准曲线上的脂肪酸含量五.注意事项1.此方法是挥发性脂肪酸总量的经验测定法，比蒸馏法测定更为简便、快速。除150mg/L以下的低浓度范围外，其测定值相对误差与气相色谱法测定总值的相对误差相近。2.此法中的反应是在严格的pH值条件下进行的，最适pH值为1.6±0.1。pH值高于2.0时，色度加剧，pH值低于1.0时，颜色难以稳定，易消失。3.如果所做的空白测定含量酸量超过200mg/L时必须用氢氧化钠蒸馏提纯己二醇。4.酸性氯化铁配制好后，应静置过夜，弃去沉淀。5.必须严格遵守操作规程，显色反应必须充分摇动。6.比色法没挥发性脂肪酸总量，方便快速，对于特定样品（特别是污水污泥体系）的准确度较高，适合于沼气发酵的常规分析。