微生物学-重组与质粒

AdvancedMicrobiology上课时间讲授题目2013.11.11原核微生物的重组和质粒2013.11.18微生物与食品2013.11.25微生物来源天然产物的生物合成2013.12.02微生物基因组学（上海交大白林泉教授）2013.12.09微生物的分离与分类鉴定2013.12.16专题汇报-被微生物成就了的吃货们第九讲原微核生物重组和质粒AdvancedMicrobiology主讲人：吴莹莹[e-mail]15960281219纲要1.细菌的重组：一般原理2.细菌的质粒（应用：质粒载体）3.DNA转化4.转导5.细菌的结合6.转座因子原核微生物的遗传物质1.染色体DNA环状或线状双链DNA,，不与组蛋白结合；单倍体；决定主要性状。2.染色体外DNA较小的共价闭合环状或线状双链DNA，如质粒；一般多拷贝；决定次要性状。3.基因一般连续排列，转录和翻译偶联1.细菌的重组：一般原理基因重组（generecombination）：将两个不同性状个体的基因通过一定的方式转移到一起，并发生重新组合，产生新的遗传性状的过程，称为基因重组(generecombination)或遗传重组。不同的亲本DNA---交换---重组重组：遗传物质在分子水平上发生的交换；杂交：在细胞水平上遗传物质的交换.杂交必然包含着重组，但重组不仅限于杂交这一形式。3.DNA转化定义：受体细胞直接吸收供体细胞的DNA片段,并与其染色体同源片段进行遗传物质交换，从而使受体细胞获得新的遗传性状的现象。转化子（transformant）：经转化后出现了供体性状的受体细胞称为转化子，即转化成功的菌落。目前已知有二十多个种的G+和G-细菌具有自然转化的能力，此过程可以发生在土壤和海洋环境中，可能是自然界遗传交换的重要方式。转化的过程I.感受态阶段受体菌成为感受态产生DNA受体位点（DNA结合蛋白）或局部原生质体化条件：特殊遗传类型诱导因子：多肽类物质、SSCS、CaCl2、低温等什么是感受态感受态：是指受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态。一个细菌能否出现感受态是由其遗传性决定的，但受环境条件的影响也很大，因而表现差别很大。感受态细胞（competentcell）：具有摄取外源DNA能力的细胞。自然感受态细胞人工感受态细胞自然感受态与人工感受态人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内。该过程与细菌自身的遗传控制无关自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性（如肺炎链球菌的感受态出现在对数生长期）受细菌自身的基因控制转化因子本质是离体的DNA片断或质粒DNA。在不同的微生物中，转化因子的形式不同，dsDNA或ssDNA。其中最易与细胞表面结合的仍是dsDNA。由于每个细胞表面能与转化因子相结合的位点有限（如肺炎链球菌约10个），因此，从外界加入无关的dsDNA就可竞争并干扰转化作用。质粒DNA也是良好的转化因子，但它们通常并不能与核染色体组发生重组。转化的频率通常为0.1％～1％，最高为20％。II.DNA的结合与吸收III.转化DNA的整合（RecA蛋白介导）4.转导转导：利用完全或部分缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。由转导作用而获得供体细胞部分遗传性状的重组受体细胞称为转导子（transductant）。携带供体部分遗传物质（DNA片段）的噬菌体称为转导噬菌体。细菌转导的二种类型：普遍性转导局限性转导普遍性转导（generalizedtransduction）由烈性或温和噬菌体在裂解寄主菌的过程中进行的任何宿主基因转导。条件：存在错误包装的可能供体寄主菌的DNA在完全降解前即被包装结果：携带供体菌DNA的噬菌体再侵染受体菌，与受体菌的DNA同源重组，形成稳定的转导子。转导模型普遍性转导的三种后果：进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子流产转导（abortivetransduction）转导DNA不能进行重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。特点：在选择培养基平板上形成微小菌落外源DNA被降解，转导失败。如果受体菌通过普遍转导获得了供体菌DNA片段后，在其体内不发生基因的交换、整合和复制，只进行转录、翻译和性状的表达。这种转导被称为流产转导.局限性转导（restrictedtransduction）由温和噬菌体通过溶原阶段连接供体菌基因后再诱导溶菌，并把供体菌特异基因带给受体菌的转导过程。在裂解寄主菌的过程中进行的任何宿主基因转导。条件：原噬菌体发生不正常切割结果：形成缺陷噬菌体（如λdgal），再侵染，整合，形成转导子。大肠杆菌中λ噬菌体的正常裂解及半乳糖基因转导噬菌体的形成过程两种转导的特性比较普遍转导局限转导转导的发生自然发生人工诱导（uv）噬菌体形成误包前噬菌体的“误切”内含DNA只含宿主DNA含噬菌体和宿主DNA转导性状供体的任何性状前噬菌体两端邻近基因转导过程双交换（转导DNA替换受体DNA同源区）转导DNA插入，使受体菌为部分二倍体5.细菌的结合通过供体菌和受体菌完整细胞间的直接接触而传递大段DNA的过程。由于在细菌和放线菌等原核生物中出现基因重组的机会极为少见，而且较缺少形态指标，所以关于细菌结合的工作直至Lederberg等1946年采用两株大肠杆菌的营养缺陷型进行实验后，才奠定方法学上的基础。中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.Taturm的多重营养缺陷型杂交实验。为了减少所培养的结果是回复突变的机会，采用了双重或三重营养缺陷型。该实验是建立在不大可能同时发生两种或三种回复突变的设想上的。结合现象的发现结合现象的证实证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（BernardDavis，1950）•结合：两个不同的微生物细胞之间接触，遗传物质进行单向转移、交换，形成一个新个体。能进行结合的微生物种类•主要在细菌和放线菌中存在。–在细菌中，G－细菌尤为普遍，如E.coli、沙门氏菌属、志贺氏菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、弧菌属、和假单胞菌属等；–放线菌中，以链霉菌属和诺卡氏菌属最为常见，其中研究得最为详细的是天蓝色链霉菌（Streptomycescoeilcolor）。–在不同属的一些菌种之间也可发生接合现象，如大肠杆菌与鼠伤寒沙门氏菌间或沙门氏菌与痢疾志贺氏菌间。•在所有对象中，接合现象研究得最多、了解得最清楚的是E.coli。E.coli是有性别分化的，决定性别的是其中的F质粒，F质粒还是合成性菌毛基因的载体。结合的过程（滚环模型）F因子的存在方式和相互关系F-F+F因子的整合方式高频重组的特点接合中DNA转移过程有着稳定的速度和严格的顺序性。染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。中断杂交技术和基因定位利用Hfr×F-的接合过程，在不同时间取样，并把样品猛烈搅拌以分散接合中的细菌，然后分析受体细菌基因型，以时间(分钟)为单位绘制遗传图谱，该图谱是细菌染色体上基因顺序的直接反映。6.转座因子转座遗传因子：位于染色体或质粒上的特殊的可移动的DNA序列。转座可引起基因的突变、重组等。依据分子结构和特点不同，分为：插入序列(insertionsequence,IS)转座子(transposon,Tn)转座噬菌体(mutatorphage)插入序列(IS)一类除了和它的转座作用有关的基因外不带有任何其它基因的转座因子。它们是较小的转座因子，可以在染色体、质粒上发现。F因子和大肠杆菌的染色体上有一些相同的插入序列如IS1、IS2等，通过这些序列间的重组，F因子可插入大肠杆菌的染色体，而使它们成为Hfr菌株。转座子(Tn)Tn中除了含有转座所必须的基因外，还含有与转座无关的一些基因，如抗药基因以及其它基因如乳糖发酵基因、热稳定肠毒素基因等。因此，Tn的转座能使宿主菌获得有关基因的特性，可作为遗传标志而易被鉴定出来。不同的符合转座子的抗性标记不同。Tn5转座子部分示意图Mu噬菌体Mu噬菌体是大肠杆菌一种温和噬菌体。通常每种温和噬菌体应整合到宿主染色体的一定位置上，可是Mu几乎可插入宿主染色体的任何一个位置上，而且游离Mu和已插入的Mu基因次序是相同的。另外，它的两端都没有粘性末端，插入某种基因中就引起改基因的突变。这些都说明它的整合方式不同于λ噬菌体，而类似于转座因子的作用。转座的遗传学效应1.插入突变失活；2.插入位置上出现新的基因；3.改变染色体结构；4.产生不稳定的突变等位基因；5.外显子改组；6.产生新的变异，有利于进化。转座子是重要的遗传学工具1.基因转导的供体2.基因定位的标记3.筛选插入突变4.菌株构建5.基因克隆（转座子标签法）导入大肠杆菌中进行结合转移实例：井冈霉素产生菌中基于全基因组转座子突变的高通量筛选方法Tn5