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第一章卫生检验综合知识“中华人民共和国计量法”是1985.9.6由中华人民共和国第二十八号主席令公布的，自1986.7.1起施行。计量法中有关的条文有：第五条：国务院计量行政部门负责建立各种计量基准器具，作为统一全国量值的最高依据。第八条：企业、事业单位根据需要，可以建立本单位使用的计量标准器具，其各项最高计量标准器具经有关人民政府计量行政部门主持考核合格后使用。第二十二条：为社会提供公证数据的产品质量检验机构，必须经省级以上人民政府计量行政部门对其计量检定、测试的能力和可靠性考核合格。计量法实施细则：1987年国家计量局发布的“中华人民共和国计量法实施细则”其中：第三十二条：为社会提供公证数据的产品质量检验机构，必须经省级以上人民政府计量行政部门计量认证。计量认证：本规范经国家技术监督局于1990年7月20日批准，并自1990年11月1日起施行。卫生部于1981年发布的《卫生标准管理办法》第一条规定：卫生标准是国家的一项重要的技术法规，是进行预防性和经常性卫生监督的重要依据。卫生标准可分为：强制性标准和推荐性标准；又分为国家标准、行业标准、地方标准和企业标准。国家标准以“GB”表示，国家推荐性标准以“GB/T”表示；卫生部发布的卫生行业标准以“WS”表示，推荐性标准表示为“WS/T”。卫生标准制定状况：建国后最早颁发的卫生标准是在1953年；正式列入国家标准编号的第一个卫生标准是1956年颁发的“工业企业设计暂行”卫生标准；到1996年底，我国已有卫生国家标准1200项，到2004年止，与劳动卫生标准配套的标准方法已有249多个；与环境卫生标准配套的居民区大气标准方法已有20多个；与食品卫生标准配套的标准方法，其中理化检验方法已有70多个，微生物学检验方法已有30多项。我国的卫生标准由“全国卫生标准技术委员会”及其专业委员会负责制定和评审，又国家质量技术监督局和卫生部审批。中华人民共和国传染病防治法：1989年2月21日第七届全国人民代表大会常务委员会第六次会议通过。2004年8月28日第十届全国人民代表大会常务委员会第十一次会议修订。中华人民共和国传染病防治法：共79条本法自2004年12月1日起施行。传染性非典性肺炎：（简称为非典性肺炎，AP）是指2002年11月起，我国局部地区发生的、主要以近距离空气非沫和密切接触传播为主的呼吸道传染病，临床主要表现为肺炎，在家庭和医院有显著的聚集现象。世界卫生组织于2003年4月16日，在13个WHO网络会议上宣布一种新的冠状病毒是DNASARS的病毒，从而为SARS防止提供了依据。第三章医学分子生物学（一）、病毒的概念：病毒是一类体积微小、结构简单、具有严格的寄生于活细胞的微小生物，它们具有下列几种基本特征：1、病毒的基本结构是由核酸（基因组）与蛋白质组成，由DNA或RNA组成核心，外有一蛋白外壳（核壳），有些病毒在核壳外面另有一层脂蛋白组成的包膜包围着。2、病毒只在活细胞中增殖，因为病毒缺乏完整细胞器等必要装置，所以必须依赖宿主细胞提供高分子合成装置和能量。3、病毒非常微小，无细胞结构，绝大多数不能用光学显微镜检查，而必须用电子显微镜才能察见。第一节核酸基本知识：一、核酸化学：DNA是脱氧核糖核酸的英文缩写。RNA与DNA差别在核糖2，位带有一个羟基。DNA①DNA起储存遗传信息作用，并以核苷酸排列顺序形式储存遗传信息。②由4种核苷酸组成DNA分子，由碱基互补维持DNA双螺旋结构。③在动植物、细菌、真菌中都含有DNA，但在病毒中（非细胞型微生物）不一定含DNA。④DNA为长丝状分子互相纠缠（jiuchan），其溶液十分粘稠。⑤它对紫外线有最强的吸收，通常用260nm波长测DNA溶液浓度，它在近中性环境中带负电核，DNA变性后OD值会升高。⑥因DNA不溶于乙醇，常用二倍量沉淀DNA⑦在变性温度时，它的粘性突然降低。⑧淬火是为了保持DNA单链状态。DNA变性后溶液慢慢冷却，DNA会自动恢复双螺旋结构。说法错误的：（1）DNA和RNA的化学结构碱基G与C通过2对氢键配对构成DNA分子说法错误的。（2）与DNA分子相比，RNA分子难水解的看法也不对。（3）许多质粒可在宿主之间进行转移的说法是不对的。形状：（1）TRNA二级结构呈三草形。（2）在细胞内RNA分子中rRNA占比例最大。（3）DNA二级结构中呈左手双螺旋的是Z构象。DNA结构、性质：在真菌中网崎片段一般为100～200核苷酸。噬菌体核酸最常见的是双链线状DNA。反式作用因子具有的DNA识别或DNA结合域，主要有螺旋/转折/螺旋（T/H/T）,锌指结构，碱性-亮氨酸拉链（bZIP），碱性-螺旋/环/螺旋（bH/L/H）。真核生物中的瑞粒酶是由RNA和蛋白质构成的。一般真核生物染色体上有5种主要的组蛋白，其中亲和力最强的两种是H3H4。二、DNA的复制和修复：（1）细胞每分裂一次，染色体DNA就合成一次，新DNA是按原DNA分子合成。（2）DNA分子拆（ca）开成两条链，依每一条单链合成一条新单链，成为半保留复制。（3）在合成DNA时限制性核酸内切酶不是合成DNA的必要条件。（4）DNA多聚酶只能结合在一长段DNA单链的一小段局部双链结构上，才能顺利开始DNA合成。（5）在DNA合成中单核苷酸分子必须顺序以共价链连接在已形成核酸链3，末端的羟基上。（6）在合成发生错误时，DNA多聚酶会切除错误核苷酸，在那个位置上重新加一个正确核苷酸。（7）在人工合成DNA时，只加一种或两种三磷酸单核苷酸，那么合成就会停止在缺失的核苷酸位置上。在大肠菌DNA损伤修复时填补缺口最重要的酶是DNA聚合酶Ⅰ。DNA三个终止密码子分别是UAA、UAG、UGA。在大肠菌中DNA复制最主要的DNA聚合酶是DNA聚合酶Ⅲ。该酶的核心聚合酶中，具有3，-5，外切酶活性的亚基是ε亚基。在体内染色DNA复制时必须有RNA引物。在哺（bu）乳动物细胞中负责合成线粒体DNA是DNA聚合酶r。RNA酶Tl可特异地作用于嘌呤核苷酸3，端磷酸并切割与相邻核苷酸相连的磷酸二酯键。体内DNA复制与体外PCR不同的是引发酶参与。与体内DNA复制不相关酶是反转录酶。在细胞内DNA合成正常进行是RecA蛋白，而RecA蛋白不具有蛋白酶活性。在大肠菌DNA聚合酶Ⅰklenow片段没有5，-3，外切酶活性。DNA修复过程中尿嘧啶糖基酶系统不包括Sl核酸酶。在逆转录酶的RNAaseH活性是一般DNA聚合酶所不具备的。在逆转录酶的最终产物双链DNA的长度较正链RNA稍长。三、转录：在生物体内，RNA合成过程称为转录。它（RNA）是按照储存在DNA上遗传信息合成。合成RNA时DNA双链也要解旋，解旋部位称启动子。去掉RNA分子5，末端的磷酸，不起合成酶功能的作用。在刺激点突变，改变某些基因功能与DNA向RNA转移无直接关系（？）（1）大肠菌的RNA聚合酶由5个亚基，其σ亚基有启动子作用。（2）利福平作用该酶（聚合酶）β亚基上。（3）RNA聚合酶Ⅰ主要是转录rRNA（构成核糖体骨架的是rRNA）。Prt-mRNA内含子的5，-末端一般是GU。（4）RNA聚合酶Ⅱ主要是转录hnRNA。在真核基因启动子近侧序列元件中，对转录起点定位起关键作用的是TATA盒。（5）放线菌素D能抑制DNA转录。编码核糖体RNA的基因是一种中度重复序列的DNA序列。四、翻译：在合成各种不同RNA中：（1）tRNA具有搬运氨基酸功能。构成核糖体骨架的是rRNA。mRNA直接决定蛋白质的结构。（2）合成蛋白质需4种核苷酸，排列组成遗传信息，然后转换成20种氨基酸，组成遗传信息称为翻译。（3）3个核苷酸排列顺序代表一种氨基酸密码，表示蛋白质合成开始的密码有一种。（4）在细菌里，依靠rRNA和mRNA之间一段互补序列能发现蛋白质合成开始的位置。（5）在核糖体上，有两个位置上暴露出mRNA（直接决定蛋白质的结构）分子相邻的两个密码子，当蛋白质合成进行到没有携带任何一种氨基酸tRNA（具有搬运功能）与其对应，这说明合成蛋白质结束，并已开始同一种蛋白质分子的合成。（6）合成蛋白质后，决定其空间结构的是蛋白质的氨基酸排列顺序确定后，就能自动折叠卷曲成一定的空间形状。（7）在原核生物核糖体是由16SrRNA、23SrRNA、5SrRNA组成，在真核生物核糖体的五种主要的组蛋白中，H1在进化中最不保守。五、基因表达调空：（1）氯霉素可与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质合成。（2）在基因5，上游基因内或其3，下游序列中存在，能提高同一条DNA链上靶基因转录速率的遗传控制元件是增强子。（3）乳糖操纵（zong）子中结构基因是LacA、LacY、LacZ。六、遗传重组：转座子的功能有（1）促进染色体重排，（2）促进基因重复，（3）促进基因扩增，（4）造成缺失突变。在大肠遗传重组中，同源重组需RecA蛋白质。第二节实验技术：一、核酸提取、纯化、浓缩○1用煮沸法从表达内切酶A的大肠菌小量制备质粒时不能省略酚-氯仿抽提。○2用煮沸法制备质粒所用溶菌酶液是用TrisCL配制的。○3用乙醇沉淀溶于SDS中RNA时，要避免用乙酸钾。○4小量制备DNA时不被限制酶切开，应用酚-氯仿抽提。○5用异丙醇沉淀核酸与用乙醇相比，最明显优点是可减少溶液体积。1、质粒DNA提取：在用碱裂解法少量提取质粒DNA时，在缓冲液（Ⅰ液）中不含SDS。多数质粒在自然状态下是环状链DNA。质粒DNA纯化方法有：○1离子交换分析；○2聚乙二醇分级沉淀；○3二凝胶过滤层析；○4氯化铯（se）-溴化乙锭梯度平衡离心。质粒具备有复制起点、抗生素抗性基因、有多种限制酶的单一切点、有较高的拷贝数。2、NA凝胶电泳：要使大于2Kb的DNA片段在凝胶电泳中分辨率达最大，其电压不应超过5V/cm。在电泳中不同构象DNA泳动率通常是：超螺旋＞线性＞切口环状。二、PCR扩增技术：PCR反应中变性、延伸温度通常是：95℃、72℃。引物的Tm值估算每个A或T加2℃。在PCR反应中每一种dNTP的浓度通常是200umol/L，在PCR反应中经n次循环后理论上，DNA链的扩增数目是2n倍。在PCR反应中引物只与靶序列的相应部分结合的说法是错误的。再此（PCR扩增技术）反应中矿物油不是必需的，用于扩增未知序列的PCR是反向PCR。不对称PCR法专用于制备单链DNA的扩增。在PCR反应DNA碱基错配率较高，原因是TaqDNA聚合酶缺乏3，-5，外切酶活性。PCR反应中的引物是DNA。反应体系中Taq酶过多及引物过多都可引起非靶序列扩增。三、寡核苷酸探针合成、放射标记、杂交标记合成寡核苷酸时dNTP的浓度不应低于1umol/L。探针是一段带标记的单链DNA，双链DNA，cDNA，单链RNA。杂交液的成分与杂交温度间的关系正确的是甲酰胺42℃，水68℃。标记探针的最有效简单方法是体外转录法。标记双链DNA的3，端时，常用T4噬菌体DNA聚合酶，而不是大肠菌DNA聚合酶Ⅰklenow片段，主要是因为3，-5，外切酶活性高。Westernblotting所用探针一般是Ab。Southenblotting一般是用于DNA分子的杂交技术。在核酸分子杂交技术基础之上又发展了一系列检测DNA和RNA的技术，如Southenblotting、Westernblotting、Dotblotting和菌落杂交。大肠菌的DNA聚合酶Ⅰ用在切口平移法标记DNA。在20℃～25℃下探针与靶序列退火速率最大，比解链温度低情况下进行杂交。将外源性质粒导入细菌中称为转化。外源性重组质粒与感受态细菌混在一起，一般在42℃作短暂的热刺激。cDNA基因克隆以mRNA为模板。四、基因克隆载体：柯(ke)斯质粒载体具有噬菌体特性，能通过溶菌周期，形成子代噬菌体颗粒的说法是不对的。五、DNA序列测定：与Sanger双脱氧链终止DNA测序法相比，Maxam-Gilbert法所测序列为原DNA分子，这是其特点。六、克隆子DNA定点诱变：Mu噬菌体DNA转座成分不含末端反向重复序列。改变蛋白质密码序列的个别密码子最好采用寡核苷酸介导诱变。七、研究DNA与