食用菌菌种的制作

第三章食用菌菌种的制作一、母种，也称一级菌种或试管种•母种鉴定：洁白，健壮，无虫害，有蘑菇香味第一节食用菌菌种的概述二、原种，也称二级菌种原种鉴定：洁白，健壮，有凝水，不干燥三、栽培种，也称三级菌种栽培种鉴定：洁白，健壮，有凝水，不干燥,一般不超过25-35天第二节培养基根据各种食用菌生长时对营养物质的要求，用人工方法配制而成的营养基质，供菌丝生长发育，把这种营养物质叫培养基。它如同农作物需要土壤、肥料，动物需要饲料一样。目前，人们采用的培养基相当多，种类各不相同。不论哪种培养基都有共同特点：一般都含有水分、碳源、氮源、无机盐以及生长因子等。碳源是构成细胞物质的主要元素，也是食用菌生长发膏所需能量来源。碳源的主要原料是糖类、淀粉、纤维素物质。代表物质是葡萄糖、蔗糖、玉米粉、麸皮、米糠、锯木屑、棉籽壳等。氮源是食用菌细胞质和细胞核中蛋白质和核酸的主要元素，蛋白质和核酸是生命的基本物质。一切生命活动都离不开这些物质。氮源主要有氨基酸、蛋白胨、尿素、硫酸铵、含有氮素的物质有玉米、棉籽壳。培养基中的无机盐虽用量不多；但不可缺少，它主要是酶类的组成成分，调节各种生命代谢活动，如磷酸二氢钾、硫酸镁。生长因子需要量很少，是培养基中的特殊营养物质，它是维持食用菌正常生长所不可缺少的生长因素。如马铃薯、麸皮、米糠等都含有丰富的生长因子，维生素也属此类。1.天然培养基：它是利用天然的有机物配制而成的培养基。这种培养基来源广，成本低，很适合实际生产。特别具备营养丰富、制备方便、经济实用等优点。但他学成分不能定量，每批成分也不稳定，因此不宜用来进行精确的科学实验。常用的天然培养基，有马铃薯培养基、麦芽汁培养基、杏汁培养基、苹果培养基、麦芽培养基、堆肥培养基等。2.半合成培养基：在天然培养基中，适当增加无机盐类，或在合成培养基中添加少量别的有机物，成为半合成培养基，介于天然培养基和合成培养基之间。主要目的是促进菌丝生长发育。3.合成培养基：用化学成分已知的有机物或无机物配制而成的培养基。由于各种化学成分已经清楚，容易控制，所以适合某些定性和定量研究。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯（去皮）200克葡萄糖20克琼脂18～20克PH值5.5～6.0制法：先将新鲜无病害的马铃薯洗净，去皮后切成小薄片，称200克，加水1000毫升，煮沸20分钟后过滤，其滤汁为马铃薯煮汁，然后加琼脂和葡萄糖煮溶，后补足水分至1000毫升，装管（瓶）灭菌备用。一般食用菌母种的分离和培养都适合此培养基。培养基的灭菌培养基装好后就要立即进行灭菌；将其中的杂菌杀死，然后才能接入我们所需要的纯菌种，进行培养。不论是母种分离时用的斜面培养基，还是原种、栽培种瓶培养基或聚丙烯塑料袋培养基，一般都采用热力灭菌法。高压蒸汽灭菌法：若是斜面试管培养基，应在1kg/cm2（121℃）压力下维持30分钟，即可达到灭菌目的。开锅取试管时，趁热放成斜面。灭菌材料如是原种和栽培种，应在1.5kg/cm2（128℃）压力保持60～90分钟，这样才能达到灭菌目的。常压蒸汽灭菌法：如没有具备高压锅，可用土蒸锅或蒸笼进行。在常压的条件下，以100℃的温度持续6～8小时，以杀死培养料中的各种杂菌。也可采用常压间歇灭菌3次，可先蒸1小时，然后隔24小时又如法蒸1次，连续3次，就可达到灭菌目的。1.加水阀2.加水池3.放气阀4.搁挡5.搁板6.锅7.炉门8.炉室9.灰门10热水锅11.烟囱12.灭菌仓灭菌效果检验培养基的灭菌效果要经常检验，是否灭菌彻底：一般情况下，灭菌后的培养基最好应放在要培养的温度下，空白培养1周，可检查灭菌效果。如果在这一段时间内培养基没发生任何变化，说明灭菌效果良好，可以使用。液体菌种简言之就是将纯正优良的菌种，接入液体培养基（固体培养基不加凝固剂），使菌丝繁殖形成大量小菌球，然后将这种培养基拌入木屑或棉籽皮料内，制成菌块、培养其形成子实体。还可用于制原种、栽培种。目前，用液体深层发酵法生产菌种，具有生产量大、周期短、菌龄整齐、成本低廉、接种方便等特点，是实现食用菌工厂化生产的目标。生产上常用的栽培种木屑、棉籽壳菌种麦粒菌种玉米粒菌种木块菌种木筷菌种牙签菌种接种技术与环境的消毒接种箱（接种室）接种室和接种箱是进行菌种分离接种的场所，和外界空间隔绝，防止空气流动，经过一定的消毒措施后，室内就可达到无菌状态，防止分离和接种时污染杂菌。一般一个接种箱就可展开工作，如有条件也可建一个接种室。无菌箱及无菌室的消毒灭菌l．用甲醛和高锰酸钾混合熏蒸：一般每平方米需40％甲醛10毫升、高锰酸钾8毫升，进行熏蒸。使用时，先密闭门窗，量甲醛溶液盛入容器中、然后倒入量好的高锰酸钾，人员随之离开接种室，关紧房门，熏蒸20—30分钟即可。2．0.1％升汞水消毒：用0.1％升汞水浸过的纱布或海绵进行揩擦，或用喷雾器喷雾灭菌，喷雾后20～30分钟，箱内的杂菌和雾滴一起落到箱底被杀死，内部的空气就变得很清洁。3．紫外线照射灭菌：在无菌箱中装一支220伏、30瓦的紫外线灯管；每次开20～30分钟，就能达到空间杀菌的目的。照射结束后，罩黑布半小时，以增强杀菌效果。4．石炭酸喷雾：在每次接种之前，用5％石炭酸溶液喷雾，可促使空气中的微粒和杂菌沉降，防止桌面微尘飞扬，并有杀菌作用。5．石灰揩擦：经常用药物熏蒸，易造成酸性环境，特别用甲醛和高锰酸钾熏蒸长久，污染往往越来越严重，预防办法可把各种药品交替使用，过一段时间（约五周）用石灰擦洗一遍，实践证明，这样做效果很好。1.接种针2.接种环3.接种钩4.接种锄5.接种铲6.接种匙7.接种刀8.接种刀9.剪刀10.钢钩11.镊子12.弹簧接种枪13.接种枪（日本式）第三节食用菌菌种分离的方法（一）组织分离法（二）孢子分离法（一）组织分离法使用组织分离复壮菌种，简便易行、效果明显，很适宜一般种植户。其操作技术要点是：⑴选择种菇：在菇床、菌墙中选择出菇早、无杂菌侵染、株型紧凑、圆整肉厚、色泽美观、七八成熟的第一潮菇的肥壮菇体作种菇；⑵种菇消毒：在种菇中部取最大的3-4张菇片，用70%的酒精轻擦表面后置于接种箱内消毒；⑶菇肉接种：将菇片纵向撕开，在每个裂面靠近菇片边缘处取一米粒大小的菇肉组织接于PDA培养基上。每张菇片共撕10个裂面，接10支试管，一次分离共接30～40支试管；⑷将试管置于15～30℃下培养；⑸培养期间每天都要检查发菌情况，从中选择菌丝浓白粗壮、边缘整齐、长速正常、无绿、黄及浆糊状等杂菌斑点的，表现最好的分离种转接于木屑麸皮培养基上，于15～30℃下培养；⑹菌丝发满后，在接种箱内去掉棉塞，用蜡封口，用黑膜包裹后于4～9℃的冰箱内保藏；⑺在下一个生产季节与原始保藏种作对比试验，择优作为生产用种。每季都如此筛选，能逐步提高菌种各方面的性状，使发菌加快，抗逆抗杂性增强，质量明显提高。（二）孢子分离法同一品种经过四年以上栽培就会表现出一些退化现象，如出菇迟，长势弱，转潮慢，产量不高等。通过有性繁殖所产生的孢子进行母种繁殖是解决种性退化的一条有效途径。因子实体孢子弹射量大，接种操作简易，在栽培专业户中推广孢子分离提纯复壮技术是可行的。１．母种孢子分离与接种（１）采菇选择菇体形态好，生长势健壮，并能代表该品种性状接近成熟的平菇子实体，采摘一丛或两丛作为种菇拿回室内备用。要求所采的子实体菌盖边缘稍卷或已接近平展。（２）装置与灭菌用0.2％新洁尔灭清洗干净３个1000毫升烧杯和３个培养皿，烘干水分后将培养皿放入烧杯底部。切取菌盖长达７～９厘米上层或中层的一朵子实体，用药棉蘸75％酒精轻擦菌盖和菌柄后，将菌褶朝下放入烧杯中的培养皿中如有插菇钢丝架更好。此操作完成后在烧杯口沿上盖好用无菌水润湿的４层沙布，上面再盖一层白纸，用皮筋扎口，以次类推连同３个同样处理的烧杯一起放入接种箱。接种箱中另放入30～40支PDA试管培养基，接种铲、镊子酒精灯等工具，用10毫升甲醛加６克高锰酸钾混合后对接种箱进行熏蒸消毒灭菌。（３）接种与培养放入接种箱用于孢子分离的平菇，经过8～12小时后就有孢子弹出，一般放１昼夜培养皿中就有厚厚一层白色孢子印，这时要及时进行接种。一朵菇体弹射的孢子量可接种10支以上试管种，接种完成后贴上标签放入25℃左右的恒温箱中培养。培养过程中，前3～4天为孢子定植期，外表看不出任何变化，7天以后孢子开始萌发并在四周长出白色绒毛状菌丝体，16～18天左右菌丝布满培养基面，即得纯菌丝母种，如有污染管应及时弃除。２．原种扩接选取10支菌丝洁白、粗壮、生长整齐的试管种进行原种的扩接，另外20支纯菌丝母种等做完出菇试验后再作留种及相关处理。一支试管种可接５瓶原种，每支试管接完要进行火焰干热灭菌后再扩接另一支试管。接种完毕后取出菌种瓶放入25℃左右恒温箱培养，菌丝满瓶后10天左右进行出菇试验。３．出菇试验一般接种10～20袋即可，接种后在适宜温度下发菌，菌丝长满后移到出菇最佳条件下进行观察。对菌丝生长速度快，吃料能力强，出菇早，朵形好，转潮快，产量高，质量好的菌种可用于扩大培养，投入栽培生产。第四节食用菌菌种的保存无论是母种、原种或栽培种，如果未及时使用，其菌丝就会很快衰老，降低生产力，影响产量和质量。因此，菌种必须进行适当的保存，其目的是防止退化，确保菌种纯一，防止杂菌感染。菌种保存的基本原理，主要是通过采用低温、干燥与缺氧的条件，以中止菌种的繁殖，降低其新陈代谢，使之处于休眠状态。1.斜面低温保存法将斜面菌种，置于冰箱内，在4℃左右低温下保存，以后每隔2～3个月转管移接一次。这种保存方法适于大多数食用菌菌种。但草菇菌种在5℃以下很快死亡；所以草菇的菌种，不必放在冰箱中，置于室温保存即可。为了延长保存时间，试管口处要用塑料薄膜包扎，以防培养基干固。在农村没有冰箱设备的，可把母种试管，用石蜡封口，再用塑料薄膜包封，沉放于清凉的井底保存。2.液体石蜡保存法食用菌的菌丝体都可用此法保存，方法简单，只在斜面菌种试管内，注入一层已灭过菌的液体石蜡，注入量以高出斜面1厘米为宜，使菌种与空气隔绝，降低其新陈代谢的活动，然后在棉塞外包以塑料薄膜，直立存放于室内干燥处或低温下保存，一般可保存一年以上。使用液体石蜡菌种时，只要用接种计从斜面上挑取少许菌体，放在新鲜的培养基上；经过培养，即可应用，原种则重新蜡封，继续保存。3.木屑试管菌种保存法用杂木屑按原种的培养基配制装入大号试管，容量为管高的三分之二，擦净管口塞紧棉塞，用牛皮纸包扎管口后高压灭菌，然后移入母种，在25～28℃下培养，待长满菌丝后，立即移到低温干燥环境保存、或埋于尿素、硝酸铵或地洞中保存，效果更好，并能延长保存时间。4.冷冻干燥保藏法这种方法采用真空、干燥、低温等手段，使菌种新陈代谢活动处于相对静止状态，在低温下快速冷冻，又在低温下真空干燥，而使菌细胞的结构与成分保持原来状态而保存菌种。还有沙土保存法、液氮超低温保藏法、滤纸片保存法、菌丝球生理盐水保藏法、麦粒保藏法、干孢子真空保藏法等。这里不一一介绍。要根据自己的工作需要及具体条件而定，一边保存，一边还要分离，复壮，做好选育工作，延续菌种的忧良性能。原种和栽培种培养好后，应立即用于扩接栽培种或栽培生产，不宜保存过久，时间越长，生活力越差，也越容易感染杂菌。若因特殊情况不能及时使用，原种瓶口用牛皮纸包好，置4～14℃条件下可保藏一年左右。栽培种短期保存也可放于阴凉、干燥通风的室内，但种瓶不宜堆叠过高，以免堆内发热，加速菌丝老化。如何防止食用菌菌种退化菌种退化会导致菌丝体生长缓慢，对环境、杂菌等的抵抗力变弱，子实体形成期提前或推后，出菇潮次不明显等现象。引起菌种退化的原因很多，其中菌种不纯和基因突变是主要原因，另外温度过高、不同菌株的混合栽培等都会引起菌种退化。防止菌种退化的措施有：保证菌种的纯培养，不要用被杂菌污染的菌种；严格控制菌种传代次数，减少机械损伤，保证菌种活力；适当低温保存菌种；避免在单一培养基中多次传代；菌种不宜过长时间使用；菌种要定期进行复壮；每年进行孢子分离，以有性繁殖来发现优良菌株，以组织分离来巩固优良菌株的遗传特性。