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项目名称：肿瘤发生发展中关键蛋白的功能与调控首席科学家：肖智雄四川大学起止年限：2012.1至2016.8依托部门：教育部四川省科技厅一、关键科学问题及研究内容本项目拟解决的关键科学问题是：原癌蛋白和抑癌蛋白通路相互作用和信号网络互动调控肿瘤发生发展的分子机制。恶性肿瘤作为细胞生长的疾病，与细胞生长、凋亡、细胞周期、肿瘤细胞迁移和侵袭等最基本的生命过程紧密相关。因此，以原癌-抑癌蛋白信号网络互动为主要切入点，发现及鉴定重要蛋白的关键新靶点及信号通路新调控机制，深入探讨原癌-抑癌蛋白信号网络信号通路的动态变化，阐明其在肿瘤发生发展过程中的关键作用，是本课题拟解决的关键科学问题。本项目将以原癌蛋白（EGFR，Ras/Rho家族，PI3K）、抑癌蛋白(p53家族、BRCA1、PTEN)以及PI3K/Akt、MAPK、GSK3b等关键信号通路为出发点，研究这些原癌蛋白-抑癌蛋白的关键上游新调控因子、下游关键新靶点及其信号网络互动在肿瘤细胞生长、凋亡、细胞周期、细胞迁移、侵袭过程以及免疫球蛋白受体从免疫防御向EMT恶性转化转变中的功能和分子调控机制。本项目的实施不仅能够完善基本生命科学理论与细胞癌变理论体系，而且为肿瘤诊断治疗提供理论指导意义和潜在的药物新靶点，并对小分子干扰和药物筛选提供新的思路和方法。围绕上述科学问题，我们将利用细胞生物学、分子生物学、生物物理学、遗传学、系统生物学及蛋白组学等交叉科学技术方法，发挥多学科团队作战的优势，结合动物肿瘤模型以及临床标本，阐明原癌-抑癌蛋白网络互动及其调控在肿瘤细胞生长、细胞周期、EMT、细胞迁移及侵袭过程中的作用。主要研究内容包括：1．解析原癌蛋白Ras/Rho家族上游调控新蛋白和下游作用新靶点在肿瘤细胞迁移的分子作用机制1）深入阐明Gankyrin等关键调控蛋白以及Hippo/MST1-YAP2信号转导通路在肿瘤迁移过程中的作用。2）鉴定恶性肿瘤迁移过程中关键调节重要信号通路中的蛋白质复合体。发现新的信号通路调控分子并揭示其作用机制。3）解析Gankyrin、Hippo/MST1-YAP2蛋白质结构及其相关调控蛋白的溶液结构，研究蛋白的相互作用机制，揭示其功能的结构基础。4）研究PIK3CA对p63的功能调控，解析PIK3CA突变体蛋白调控p63蛋白表达的分子机制，阐明PI3K通路与p63调控细胞迁移和侵袭的功能相关性。5）应用常见肿瘤标本，对Gankyrin、Hippo/MST1-YAP2、TAp63和ΔNp63基因等的表达进行定性、定量和定位分析，揭示其在肿瘤中表达的动态时空关系。2．阐明抑癌蛋白p53家族的下游关键新靶点以及上游调控新蛋白对肿瘤发生发展的分子调控机制1）研究p53下游新靶点Killin对S期监控点的调控，阐明Killin抑制DNA合成、激活CHK1/2的分子途径及凋亡机理，确定Killin/N8-50多肽与DNA结合前后的结构。2）解析p53选择性调控的分子机制，从KRAB锌指蛋白家族中筛选p53调控分子，确定其调控的细胞学效应。3）解析SIRT1-p53复合体的晶体结构。4）阐明p63-CD82通路调控细胞迁移和侵袭的机理，研究p63调控MAPK的机制，阐明p63-MAPK通路与细胞迁移和侵袭的相关性。3．揭示细胞周期中关键蛋白调控有丝分裂和染色体稳定性及在肿瘤发生发展中的功能和调控1）建立微管动态不稳定性的检测分析体系，阐明微管相关蛋白(e.g.PRC1)对微管动态不稳定性的直接调控机制。2）揭示微管相关蛋白(PRC1，Nlp)及其磷酸化修饰对有丝分裂的调控机制。3）应用动物模型并结合人类肿瘤标本检测，明确微管相关蛋白(PRC1，Nlp)及其磷酸化修饰与恶性肿瘤发生发展及转移的关系。4）解析微管相关蛋白(PRC1，Nlp及其截短体)的三维结构。4．探究p53、RTK及免疫球蛋白受体三者之间动态调控机制在pIgR诱导EMT恶性转化中的影响选择有深厚研究背景的、与EMT恶性转化密切相关的pIgR为主攻研究对象，以免疫球蛋白转运调控与恶性转化调控系统为核心研究内容，构建工程细胞株、工程动物模型等研究系统，探究pIgREMT恶性转化的分子机制，重点从免疫防御向免疫背叛转变的分子开关以及受体酪氨酸激酶家族和p53对其调控机制两个研究视角出发，研究pIgR功能逆转的动态调控机制，阐明p53、RTK及免疫球蛋白受体三者之间动态调控机制，剖析EMT恶性转化调控网络的关键节点分子；在此基础上，引入“基因敲除”与“化学干预”平行研究策略，利用国家化合物库，筛选发现小分子调控探针，从外源性干预角度入手，佐证内源性调控的本质。四个子课题研究内容相互关联，从点到面，将深入探讨原癌-抑癌蛋白信号网络互动在肿瘤发生发展过程中的重要作用和分子机制。二、预期目标本课题总体目标是以恶性肿瘤细胞为研究对象，深入探讨原癌蛋白-抑癌蛋白通路相互作用和信号网络互动在细胞生长、凋亡、细胞周期和肿瘤细胞迁移等最基本生命过程中的功能和调控，发现和鉴定肿瘤发生发展中新的关键调控蛋白。我们的研究将进一步完善现有生命科学基础理论以及细胞癌变理论体系，同时以这些信号通路网络和重要蛋白质的分子作用机制为突破点，为癌症治疗提供新策略和新靶点。力求在肿瘤发生发展领域中取得原创性、前瞻性、突破性研究进展，提升我国癌症研究水平，保持国际先进行列。本项目的五年预期目标：1．建立一系列适合于肿瘤生长凋亡、迁移和侵袭研究的抑癌蛋白相互作用研究体系，筛选、发现和鉴定一批选择性p53家族上游调控蛋白、全新性下游作用靶点及其相互作用，阐明p53-p63信号网络在肿瘤细胞迁移和侵袭中的作用机制。2．建立一系列适合肿瘤迁移和侵袭研究的原癌蛋白通路的研究体系，揭示恶性肿瘤迁移过程中GTPaseRas/Rho家族蛋白的关键重要信号通路及网络互动的功能特点。3．研究细胞周期调控关键蛋白对有丝分裂调控的分子作用机制，揭示该类蛋白及其网络互动在恶性肿瘤发生发展过程中的关键作用。4．明确免疫球蛋白受体pIgR在EMT恶性转化中的重要作用，揭示免疫球蛋白受体pIgR诱导EMT恶性转化的分子机制。5．人才培养及基地建设：人才培养：为我国培养一批研究肿瘤发生发展机制的创新性人才，打造一支颇具国际竞争力的优秀创新群体，重点培养2-3名国际知名领衔学科带头人、2-3名国家杰出青年获得者、2-3名中国科学院百人计划入选者和一批博士后、博士生、硕士生。希望通过本项目的实施，取得具有国际影响力并原创性科研成果。在国际重要学术刊物上发表高水平论文50篇以上，其中在影响因子大于10的刊物上发表10-15篇，申请专利10-15项。基地建设：综合应用基因差异筛选技术、蛋白质组学技术、细胞内蛋白质三维结构成像技术、活细胞与活体成像技术、肿瘤细胞迁移研究技术、体外微管动态不稳定性分析技术、遗传操作与模式动物技术、X射线单晶衍射分析结合二维和多维核磁共振（NMR）技术，建立体内外多参数同步化、时空定量可视化的原癌蛋白与抑癌蛋白结构与功能研究体系，打造国际同行瞩目的代表中国原创水平的从事原癌蛋白与抑癌蛋白之间网络互动与肿瘤发生发展机制研究的平台基地。课题设置：1．课题设置的总体思路课题的设置主要考虑当前癌症研究领域的研究重点和发展趋势，并结合我国常见恶性肿瘤诊治水平提高的重大需求。以研究原癌蛋白-抑癌蛋白网络通路及其调控在细胞生长增殖、细胞周期调控、肿瘤细胞迁移和炎癌转化等方面的分子机制为出发点，深入探讨原癌蛋白-抑癌蛋白信号网络互动，以原癌蛋白Ras/Rho家族、PI3K/Akt、GSK3b等以及抑癌蛋白p53家族、BRCA1、PTEN及其网络互动为切入点，研究新的上下游调控蛋白的生物学功能及其在肿瘤发生发展中的作用。并以这些关键蛋白为靶点，筛选可调控其功能的小分子化合物，为临床肿瘤诊疗奠定分子生物学基础。2．各课题研究内容及其与项目预期目标的关系本项目的设置以上述思路为基础，分为四个课题：（1）研究原癌蛋白Ras/Rho家族新的上游调控蛋白和下游作用靶点在EMT、肿瘤转移的分子作用机制；（2）研究抑癌蛋白p53家族下游关键新靶点、上游调控新蛋白、以及相关信号通路对细胞生长、凋亡、细胞周期、细胞迁移和侵袭的功能和调控；（3）研究细胞周期中关键新蛋白调控有丝分裂、染色体组稳定性以及在肿瘤发生发展中的作用；（4）研究免疫蛋白和小分子化合物在EMT和肿瘤转移的调控与干预的分子机制。本项目以正常细胞癌变过程中最基本的生物学过程，包括细胞周期、细胞增殖与凋亡、EMT和细胞迁移和侵袭为中心，以调控这些基本生物学过程的关键蛋白和信号通路为主线。前两个课题分别从原癌蛋白Ras/Rho家族和抑癌蛋白p53家族的功能、信号通路和调控机制进行并行和相互交叉的研究；课题三着重研究生命现象中最基本的细胞周期中调控有丝分裂的关键蛋白，及其与前两个课题所涉及的原癌蛋白－抑癌蛋白信号网络中关键蛋白的互动；课题四研究免疫球蛋白受体以及受体酪氨酸激酶家族对EMT和肿瘤转移的调控网络。同时研究小分子化合物对这些过程的干扰，为肿瘤诊断治疗提供新方法和新靶点。本项目的主要目标是深入研究原癌-抑癌蛋白的相互作用。课题一和课题二以原癌蛋白PIK3CA、Apak、Gankyrin、调控抑制癌蛋白p53、p63为主线。同时研究p53、p63对PI3K和MAPK等关键生长信号通路的反馈调控。课题三以细胞有丝分裂调控关键蛋白PRC1、Nlp为切入点，研究微管相关蛋白网络对细胞有丝分裂过程中纺锤体形成以及中心体、染色体分离的调控，同时研究p53对这些蛋白分子及其网络互动的上游调控。课题四以免疫球蛋白受体EMT恶性转化的分子机制研究为切入点，研究免疫球蛋白受体功能逆转的动态调控机制以及p53、RTK及免疫球蛋白受体三者之间动态调控机制，剖析EMT恶性转化中新的关键节点蛋白的结构组成，阐明其动态变化的网络调控机制。四个子课题研究平台相互交叉、研究内容相互关联，从点到面，课题一和课题二中已建立的蛋白组学、蛋白质结构解析平台、和课题四已建立的小分子化合物筛选平台为整个项目研究关键蛋白的功能、调控及分子机制提供技术平台和支持。其相互关系如下图所示：三、研究方案课题一：研究原癌蛋白Ras/Rho家族上游调控蛋白和下游作用靶点在肿瘤细胞迁移的分子作用机制基于原癌蛋白Ras等诱导肿瘤的小鼠模型，利用ORIS系统，应用高通量基因沉默技术和高内涵技术等手段鉴定恶性肿瘤迁移过程中关键蛋白质，并探讨这些蛋白质在肿瘤发生发展过程中的功能与调控；深入研究Gankyrin等癌基因以及Hippo/MST1-YAP2信号转导通路在肿瘤迁移中的作用；人肿瘤中Gankyrin等关键调控蛋白的表达水平与肿瘤细胞的转移程度的相关性分析；利用NMR解析Gankyrin等关键蛋白质及其复合体的结构，我们将利用已建立的稳定表达各种PIK3CA突变体的细胞株分析PI3K信号通路调控ΔNp63蛋白表达的分子机制。利用特异性磷酸化抗体重点探索Akt蛋白激酶激活状态对ΔNp63蛋白表达调控的影响。验证p63是否是介导PI3K信号通路调控肿瘤转移的关键因素。研究并评估p63信号通路在肿瘤细胞迁移和侵袭中的临床相关性。承担单位：四川大学，军事医学科学院，中科院生物物理所课题负责人：肖智雄教授主要学术骨干：李慧艳副研究员，袁增强研究员经费比例：27%课题二：研究抑癌蛋白p53家族及新的上游调控蛋白和下游作用靶点对肿瘤发生发展的分子调控机制研究p53下游新靶点蛋白Killin对细胞周期S期监控点的功能和调控。明确Killin在S期染色质上的定位、及其与DNA复制蛋白RPA和PCNA之间相互关系，阐明Killin抑制DNA合成的分子机理。揭示Killin在DNA损伤应答过程中的功能，阐明Killin激活DNA监测点蛋白CHK1和CHK2的分子途径及细胞凋亡机理，为肿瘤化疗放疗提供进一步的理论基础。通过NMR溶液结构分析，确定Killin/N8-50多肽与DNA结合前后的结构及抑制DNA合成的分子机理。解析对p53蛋白功能选择性调控的分子机制。以我们新发现的选择性调控p53下游细胞凋亡活